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小分子活性肽在药物研究中的应用 作为药物、疫苗、诊断试剂和药物筛选剂的新趋势，已成为药物研究的趋势。 1. 噬菌体克氏原螯虾生物活性 噬菌体展示肽库是将编码短肽的外源基因插入到丝状噬菌体基因Ⅲ (gⅢ) 或Ⅷ (gⅧ) , 使得多肽以融合蛋白形式连接在PⅢ或PⅧ的N端, 表达在噬菌体颗粒表面, 而多肽的表达不影响和干扰噬菌体生活周期, 然后利用生物素或酶标记的抗体或受体, 细胞因子为钓饵分子筛选出特异的噬菌体, 并进行扩增、再筛选, 得到目的短肽克隆, 然后对所选出的噬菌体克隆进行DNA测序, 并从DNA序列推导氨基酸序列, 进而进行短肽的化学合成, 验证生物活性。典型的例子是利用噬菌体展示方法, 分离得到一20个残基的肽, 它能模拟红细胞生成素的活性, 促进红细胞生成素的二聚化和激活。噬菌体展示肽库技术具有高库容、高效方便及灵活等特点。其缺点是库容多样性易受到多种因素的影响, 且获得的是小分子肽亲和力较低。表1列举一些筛选肽类的例子。 2. -ngf肽链 此法为经典方法, 结合目前先进的分离和检测技术, 尤其是亲和色谱为基础的各种方法和仪器的使用, 使从降解的肽混合物中快速有效的分离活性肽成为可能。化学法用CNBr作用于Met-X, NTCB作用于Lys-X, IBA作用于Trp-X, 甲醇作用于Asp-Pro;酶法用胰蛋白酶、胃蛋白酶等。例如: 神经生长因子 (NGF) 能够促进交感神经原的成熟, 并维持其正常功能, 在中枢神经中有重要的生理意义, 在治疗和预防神经系统退化性疾病, 早老性痴呆症、帕金森综合征、脑血栓后遗症等方面有良好的应用前景。由于血脑屏障, NGF大分子肽链难以发挥作用。李贤慧等根据NGF的氨基酸序列及其晶体构象资料对β-NGF进行化学和酶解, 选择溴化氰在9位Met处, 胰蛋白酶在Arg或Lys处裂解β-NGF, 用Sephadex G50色谱, DE52离子交换色谱和反相高效液相色谱进行分离纯化, 获得片段用pc12细胞测活, 获得一可诱导pc12细胞分化的活性片段。此片段有16肽 (GEFSVCDSVSVWVGDK) 与14肽 (HWNSYCTTTHTFVK) 通过一对二硫键连接而成, 二片段与β-NGF肽链的10～25和77～88位氨基酸残基序列相对应, 最佳活性作用浓度为1～100 mg/L。应用降解法已成功从多种蛋白质, 如α酪蛋白、β酪蛋白、谷蛋白、细胞色素b、珠蛋白、血清白蛋白和肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱脂酶等中分离得到吗啡样小肽和多种蛋白质抗原表位多肽。 3. mhc-多肽结合模体的构建 主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC) 在抗原的递呈和T细胞的激活中起重要作用。T细胞的激活及发挥免疫作用的先决条件是MHC和抗原之间紧密结合, 形成一个复合体。在这个复合体中, 与MHC结合的不是完整的抗原分子, 而是短肽。研究表明在MHC-1类和MHC-2类的分子顶部都存在一个狭长裂缝, MHC-1正好与8～10氨基酸多肽结合, MHC-2与大约10～15个氨基酸多肽结合, 尤其是MHC-1结合肽含有保守性氨基酸, 同一MHC等位型具有一致的MHC特异的多肽结合模体 (MHC binding motif) 。因此根据MHC-多肽复合体三维构象, 结合多肽的氨基酸序列信息以及MHC类分子多态性可以指导抗原性多肽的设计, 目前已有多种MHC结合肽预测软件。表2是一些等位型MHC-多肽序列。 4. cd4抑制剂的设计 近年来由于结构生物学的发展, 运用X射线晶体技术, 核磁共振 (NMR) 技术, 相当数量的蛋白质以及一些核酸、糖类的三维结构已被人们精确测定, 到2003年9月2日在PDB (protein data bank) 库中收集的生物大分子空间结构数据已达到22333套, 其中蛋白质, 肽和病毒20152套, 蛋白质和核酸复合物934套, 核酸1229套, 糖18套。这使基于蛋白质和核酸结构上的药物分子设计成为可能, 任何药物都是通过受体发挥作用, 而受体往往是蛋白质或核酸。知道大分子结构, 就容易发现哪些成分与受体发生特异结合, 以及相互结合的位点, 使得药物的筛选与设计有科学依据, 避免盲目性。如Takasaki等根据TNFα和TNFβ/TNF-1受体复合物的晶体结构, 设计了与TNF-1受体三个关键结合点相对应的小分子外环模拟肽, 用可溶性TNF-1受体和完整的TNF-1受体评价模拟肽的拮抗活性, 其中, WP9QY序列为YCWSQYLCY, 拮抗性最好, IC50为5 μmol/L。此肽模拟TNF-1受体3功能区1环即最关键的相互作用点, 有效地抑制TNF-α介导的细胞凋亡。CD4和主要组织相容性复合体结合, 使C