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plga-丝素-胶原纳米三维多孔支架的制备及细胞相容性研究 周围神经损伤的恢复和重建是临床难题，也是组织工程的有效解决。SC在神经再生和功能恢复中具有重要作用，组织工程神经的制备需要大量SC及良好的支架载体。纳米纤维支架具有拟生性好、比表面积大、高渗透性、可控释活性物质等优点，胶原是ECM的主要结构成分，具有良好拟生性能；PLGA可降解，具有良好的机械性能；蚕丝有较高的强度和柔性，对水和氧通透性好。将采用静电纺丝法制作的PLGA、丝素、胶原纳米支架与细胞复合后，细胞能在支架上生长。但利用纳米技术制作PLGA-丝素-胶原三维多孔支架并将其应用于神经组织工程，目前报道较少。我们的实验采用静电纺丝法制备PLGA-丝素-胶原和单纯PLGA纳米三维多孔支架，观察其理化性质，并将其与SC复合培养，评价其细胞相容性，为纳米组织工程神经的进一步研究和临床应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料、试剂与仪器 3 d龄SD近交系乳鼠8只，雌雄各半，体重15～24 g，由四川大学华西医学实验动物中心提供。PLGA(1∶1，与四川大学生命科学中心联合研制）；蚕丝（双宫丝，成都天友丝绸公司）；水溶性胶原蛋白（相对分子质量6 000×103,AR级，四川铭让生物科技有限公司）；六氟异丙醇（Sigma公司，美国）；遗传霉素（GIBCO公司，美国）；抗S-100蛋白多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）。BGG40/2高压直流电源（天津大学新技术开发中心）；Reger 3050材料试验机（深圳瑞格公司）；激光扫描共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；扫描电镜（JEOL公司，日本）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）。 1.2 静电纺丝plaga的制备 电纺丝溶液的制备：将蚕丝于0.1%Na2CO3水溶液中煮沸30 min，重复3次，去除丝胶。将丝素用CaCl2、H2O、C2H5OH三元溶液（摩尔比1∶8∶2）在78～80℃下溶解，溶液经透析过滤后置于ABS盘内室温干燥成再生丝素膜。将再生丝素膜、水溶性胶原蛋白粉末及PLGA按质量比1∶1∶2共同溶于六氟异丙醇中，PLGA终浓度2%，作为实验组；将单纯2%PLGA溶于六氟异丙醇中作为对照组。 将两组电纺丝溶液加入安装了已磨钝的12号不锈钢针头的10 mL注射器，针头与BGG40/2高压直流电源的正极相连，针头下方安装1个接地铜板，上覆铝箔作为纤维的接收屏与高压直流电源负极相连。在外加电压10 kV，接收距离10 cm，电纺丝溶液流量为4 mL/h的条件下进行静电纺丝。收集接收屏表面获得的无纺纤维毡，置于干燥器中干燥后裁剪成10 mm×10 mm大小的样品作为支架备用。 1.3 物理性能评价 1.3.1 描电镜观察 将两组支架样品表面喷铂金处理后，扫描电镜观察。实验组和对照组各取5个样品，每个样品选取5个视野，每个视野测量10个纤维直径值，取均值进行分析。 1.3.2 孔隙率的测定 采用压汞法测定支架孔隙率。两组各取5个样品测定体积后抽真空，将汞充至多孔支架周围，再从外部对汞加压，记录压力和加压过程中进入孔中汞的体积，孔隙率=进入孔中汞体积/支架材料体积×100%。 1.3.3 滤纸吸干性能 两组各取5个样品置于双蒸水中24 h，滤纸吸干表面的水分称重（Ww），冻干后称重（Wd），吸水率=[（Ww-Wd）/Wd]×100%。 1.3.4 抗张力测试 两组各取5个样品置于Reger3050材料试验机上进行拉伸试验，测定抗拉强度，拉伸速率为100 mm/min。 1.4 体外生长曲线 无菌条件下取SD近交系乳鼠双侧臂丛神经和坐骨神经，置入Hank液中，解剖显微镜下剔除外膜，剪碎后用0.25%胰蛋白酶和0.03%胶原酶混合液消化30 min。将细胞悬液按1×105个/mL细胞密度接种于预涂有多聚赖氨酸的培养瓶，于37℃、5%CO2孵箱中培养30 min，收集未贴壁细胞重新接种于培养瓶中，含20%FBS的DMEM培养基培养24 h，更换为含有G418(100 g/mL）的DMEM培养基，48 h后更换为DMEM培养基，培养24 h后再换无血清培养基，培养72 h后更换为含20%FBS的DMEM培养基，以去除成纤维细胞。8～10 d细胞长满瓶底后采用0.025%胰蛋白酶-EDTA传代。倒置相差显微镜下观察生长情况。 取第4代SC按5×104个/mL细胞密度接种至盖玻片上，待长满盖玻片70%后，采用S-100免疫组织化学染色观察，在100倍显微镜下，每张玻片随机选择10个视野，计数每个视野的阳性细胞和阴性细胞数，计算阳性细胞百分比，表示SC纯度。 1.5 细胞毒性试验 1.5.1 纳米三维多孔提取物提取物 将无血清DMEM培养液与两组支架采用国家标准制备浸提液，并用DMEM和FBS配成含20%FBS的25