第八章酶免疫技术.pptVIP

碱性磷酸酶（ALP） 菌源性ALP 肠粘膜ALP(小牛) β–半乳糖苷酶（β-Gal） 常用酶 大肠埃希氏菌 第二十九页，共六十页，2022年，8月28日 ALP的 底物 β-Gal 的底物 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） 经ALP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。 常用底物 第三十页，共六十页，2022年，8月28日 二、酶标记抗体或抗原的方法 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 第三十一页，共六十页，2022年，8月28日 抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。 制备方法要求 第三十二页，共六十页，2022年，8月28日 制备方法 过碘酸钠法（直接法） 常用于HRP标记抗体或抗原 戊二醛交联法 第三十三页，共六十页，2022年，8月28日 戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。 第三十四页，共六十页，2022年，8月28日 纯化 标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200/G-150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯 亲和层析效果更好（SPA-IgG;ConA-HRP） 二、酶标记物的纯化和鉴定 第三十五页，共六十页，2022年，8月28日 鉴定 质量鉴定（ELISA法直接测定） HRP标记IgG的酶标记率（戊二醛法） 酶结合量（mg/ml） IgG量（mg/ml） HRP/ IgG摩尔比 酶的标记率 第三十六页，共六十页，2022年，8月28日 四、最适工作浓度的选择(棋盘法) 10 ++ 1:1000 1.17 10 + 1:1000 0.15 10 - 1:1000 0.09 1.0 ++ 1:1000 2 1.0 + 1:1000 0.26 1.0 - 1:1000 0.12 0.1 ++ 1:1000 0.42 0.1 + 1:1000 0.14 0.1 - 1:1000 0.11 10 ++ 1:5000 0.46 10 + 1:5000 0.03 10 - 1:5000 0 1.0 ++ 1:5000 0.9 1.0 + 1:5000 0.12 1.0 - 1:5000 0.01 0.1 ++ 1:5000 0.12 0.1 + 1:5000 0.04 0.1 - 1:5000 0.02 10 ++ 1:10000 0.12 10 + 1:10000 0 10 1:10000 0 1.0 ++ 1:10000 0.22 1.0 + 1:10000 0.01 1.0 - 1:10000 0 0.1 ++ 1:10000 0.03 0.1 + 1:10000 0 0.1 - 1:10000 0 第三十七页，共六十页，2022年，8月28日 五、测定方法的标准化 包被 加样 洗涤 孵育 结果判定 第三十八页，共六十页，2022年，8月28日 第三十九页，共六十页，2022年，8月28日 第四十页，共六十页，2022年，8月28日 理想coating：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附牢固；非特异性吸附较少 包被机制 1、物理性吸附（被动的） 2、共价交联（戊二醛，标准化） 影响包被的因素 1、包被物质的性质及其浓度 2、包被缓冲溶液的pH及离子强度 3、包被温度和时间 第四十一页，共六十页，2022年，8月28日 包被物质的性质及其浓度 聚苯乙烯吸附抗原效果好 聚乙烯吸附抗体效果好 浓度过高引起前带现象 浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭) 包被缓冲溶液的pH及离子强度 相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面 包被温度和时间 置4℃冰箱过夜，或37 ℃孵育2h 第四十二页，共六十页，2022年，8月28日 第一页，共六十页，2022年，8月28日 第一节　酶免疫技术的原理 第二节 酶免