体外皮肤变态反应 人细胞系活化试验、氨基酸衍生化反应、用化学原料荧光素渗漏试验方法.docxVIP

9.体外皮肤变态反应 人细胞系活化试验 　　　　　10.体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法 　　　　　11.化妆品用化学原料荧光素渗漏试验方法 附件9 体外皮肤变态反应 人细胞系活化试验 In Vitro Skin Sensitisation：Human Cell Line Activation Test（h-CLAT） 1 范围 本方法规定了体外皮肤变态反应：人细胞系活化试验的基本原则、要求和方法。 本方法适用于可溶或者能形成稳定分散体系的化妆品用化学原料安全性毒理学检测。 2 试验目的 预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在皮肤致敏性。 3 定义 3.1 细胞75%存活率浓度值 75% cell viability 用受试物染毒后，细胞存活率为75%时对应的受试物浓度值。 3.2 荧光强度均值 Mean Fluorescence Intensity 用流式细胞仪测定的荧光强度几何平均数。 3.3 相对荧光强度值 Relative Fluorescence Intensity 扣除同型对照后，100倍的受试物MFI和溶剂对照MFI的比值。 3.4 CD86有效作用浓度值 Effective Concentration 150 CD86的相对荧光强度值达到150时对应的受试物浓度值。 3.5 CD54有效作用浓度值 Effective Concentration 200 CD54的相对荧光强度值达到200时对应的受试物浓度值。 4 试验原理 当致敏物接触皮肤后，树突状细胞在移动到淋巴器官的过程中分化成熟，并上调一系列表面分子的表达。体外培养类树突状细胞人急性单核白血病细胞，并和受试物共暴露24h后，使用荧光抗体染料对细胞表面分子CD86、CD54染色并用流式细胞仪测定，从而判定待测物是否具有致敏性。 5 试验方法 5.1 试验材料与试剂 5.1.1 细胞 选用人急性单核白血病细胞（The human monocytic leukaemia cell line，THP-1）。要求：来源清晰，代数明确（ 30代）。细胞使用前应进行稳定性检测，通过稳定性检测后可用于本试验。 5.1.2 培养基 1640基础培养液中加入0.05 mM的β-巯基乙醇、10%胎牛血清、100 units/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，配制成1640完全培养基。 5.1.3 磷酸盐缓冲液（PBS） 氯化钠9.00 g、七水磷酸氢二钠0.73 g、无水磷酸二氢钾0.21 g，去离子水定容至1000 mL，调pH=7.2~7.4，高压灭菌。 5.1.4 染色缓冲液 PBS溶液中加入0.1%（m/v）的牛血清白蛋白。 5.1.5 染料和抗体类物质 7-氨基放线素菌-D染料（7-AAD） FITC标记的小鼠单克隆CD86抗体（FITC-CD86） PE标记的小鼠单克隆CD54抗体（PE-CD54） FITC标记的小鼠IgG1 （FITC-IgG1） PE标记的小鼠IgG1 （PE-IgG1） Fc段受体阻断剂（Fc-Blocker） 5.1.6 受试物储备液 于实验前一天准备。用生理盐水或1640完全培养基配制100 mg/mL的受试物溶液，2倍倍比稀释，得到8个浓度点的储备液系列。不能溶解于上述溶剂的物质选用DMSO作为溶剂，配制浓度500 mg/mL受试物溶液，2倍倍比稀释配制得到8个浓度点的储备液系列。 5.1.7 受试物工作液 实验当天，溶于1640完全培养基（或生理盐水）的受试物储备液系列依次用1640完全培养基稀释50倍得到工作液。溶于DMSO的受试物储备液系列依次用1640完全培养基或生理盐水稀释250倍得到工作液。将工作液等体积加入细胞悬液中进行染毒，所以最终细胞接触浓度是工作液浓度再稀释2倍。如果以上浓度无法测得受试物的细胞75%存活率浓度值（75% cell viability，CV75），可以进行浓度调整。但溶解于生理盐水或1640完全培养基的受试物最终细胞接触浓度最高不超过5 mg/mL；溶解于DMSO的受试物最终细胞接触浓度最高不超过1 mg/mL，DMSO最终接触浓度不得超过0.2%。 5.1.8 溶剂选择 选用DMSO、1640完全培养基或者生理盐水作为溶剂。在证明溶剂不影响测试结果的情况下，可使用除生理盐水，培养基，DMSO以外的其他溶剂。 5.1.9 阳性对照 选用2,4-二硝基氯苯（DNCB，CAS：97-00-7，≥99%）作为阳性对照。根据细胞75%存活率情况确定阳性对照浓度。 5.1.10 阴性对照 选用乳酸（LA，CAS：50-21-5，≥85%）作为阴性对照。根据细胞75%存活率情况确定阴性对照浓度。 5.2 试验步骤 5.2.1 细胞培养