j第八章目的基因的表达.pptxVIP

目前一页\总数一百七十页\编于十四点;第八章 克隆基因的表达;遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（central dogma）。;二、克隆基因的表达：;用原核生物作宿主;一、原核生物基因表达的特点;5’ 3’;目前八页\总数一百七十页\编于十四点;4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。;二、原核表达系统的注意事项!;三、原核生物基因表达的调控;consensus sequences;TATAAT;原核启动子共有序列的功能;（2）翻译的起始位点;位于SD序列下游。 AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）;内终止子;原因：;5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板) 转录↓ 5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA);目前二十页\总数一百七十页\编于十四点;大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。;（1）最佳启动子必须具备的条件 ① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。 ②应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。;来自大肠杆菌的乳糖操纵子。 用乳糖或其类似物 IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。;（3）色氨酸启动子trp;trpR;trpR;目前二十七页\总数一百七十页\编于十四点;目前二十八页\总数一百七十页\编于十四点;四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位;使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞;2. 周质中表达;（3）常用的原核信号肽 ①大肠杆菌的信号肽： phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、 β-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等;②金黄色葡萄球菌的蛋白A。;3. 胞外表达;目前三十五页\总数一百七十页\编于十四点;ATG-外源基因-TAG;（1）pKK223-3 载体P87;③调节基因：;tac P;必须选择一个有lacI 的宿主菌。;2. 分泌型表达载体P92;lac O S-D/ATG ompa;pIN III-comA1;融合蛋白表达载体系统----pGEX系列P90 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 优点 便于融合蛋白的分离和纯化。 组成结构 ①启动子：tac ②操纵基因：lacP ③调节基因：lacI ④S-D序列 22;S-D/ATG GST;（4）产物分离;pGEX;EcoR I;（5）其他融合蛋白系统P91;六、影响外源基因表达效率的因素 1. 启动子的结构对表达效率的影响 （1）一致顺序 ① -35box 5’-TTGACA-3’ RNA聚合酶 σ亚基的识别位点 ② -10box（Pribnow Box） 5’-TATAAT-3’;（2）-35区与-10区之间的距离;5’-AGGAGGU-3’;（2）起始密码AUG AUG左侧的三个碱基也有影响。 -半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。;SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3-9个碱基。 在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。;3. 启动子与外源基因之间的距离;4. 转录终止区对表达效率的影响;七、提高表达水平常用的方法;增加mRNA的拷贝数和稳定性 去除转录物内的衰减和非特异终止，加入抗终止的序列元件，加放正常转录终止序列。选用RNase缺失的受体菌 减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。 （1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。一般采用温度诱导或药物诱导。;32°C: cI857阻遏物有活性，抑制 PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。 42°C: cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。;调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。;（2）表达载体诱导复制;（1）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。;（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。 ①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ②大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 ③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。;（3）表达分泌蛋白;细菌蛋白分泌的条件：;② 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。;九、外源蛋白质表达后的正