基因敲除完整版.ppt

* * 基因敲除 一、基因敲除技术简介 二、基因敲除方法 三、基因敲除技术的应用前景 一、基因敲除技术简介 基因敲除(gene knockout)又称基因打靶(gene targeting)是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。它是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的,具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点,目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。 一、基因敲除技术简介 :基因敲除是通过一定的途径使机体内特定的基因发生突变或缺失的技术，通过观察基因缺失引起的表型变化，进而推测该基因的生物学功能。早期的基因敲除主要是利用DNA同源重组原理，通过设计同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。 基因敲除原理 一、基因敲除技术简介 研究现状：至今，科学家们已经分别敲除了一万多种小鼠基因（约占所有基因的一半），搞清了许多基因的功能，并建立起了五百多种动物疾病模型。这对疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗来说具有重大意义，也为改造生物、培育新的生物品种提供了可能性。 在人类基因组序列分析的结构基因组学的研究完成后,基因敲除将成为在功能基因组学研究中最直接和最有效的方法之一。 二、基因敲除的方法 传统基因敲除方法 利用同源重组 应用随机插入突变 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲除手段 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。 利用随机插入突变进行基因敲除。 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因组范围内敲除任一基因目。 二、基因敲除的方法 新兴的基因敲除技术： 1、利用 RNA 干扰引起的基因敲除 RNA 干扰( RNA in-terference，RNAi) 是 RNA 依赖的基因沉默现象，是双链 RNA( double stranded RNA，dsRNA) 分子在 mRNA 水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默。 2、锌指核酸酶基因打靶技术 该技术是将特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白，利用 ZFNS（锌指核酸酶） 人为造成特定基因位点的DNA 双链切口( Double strands breaks，DSB) ,再利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复，从而实现高效率的基因定点修饰。 二、基因敲除的方法 3、利用 TALEN 切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲除 TALE 蛋白中的 DNA 结合域与 Fok I 核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行 DNA 操作，如敲入( Knock － in) 、敲出( Knock － out) 或点突变。 4、Cas9 基因敲除技术 主要由细菌和古细菌通过一种不断进化适应的免疫防御系统改造而成，II型 CＲISPＲ/Cas9 免疫系统依赖 Cas9 内切酶家族靶向和剪切外源 DNA。 二、基因敲除的方法 CRISPER/Cas系统的由来： CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats）广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统，该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。 CRISPR/Cas系统的分类： TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒。 CRISPR/Cas的基因座结构 3端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成 5端为tracrRNA基因 中间为一系列Cas蛋 白 编 码 基 因 ， 包 括 Cas9, Cas1, Cas2和Cs