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多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰研究进展 二聚乙醇是一种具有独特理化性质的大型聚合物。它具有良好的渗透性，可与二氯甲烷、n二甲胺、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂混合。二聚乙醇是由环氧乙烷聚合而成的。根据反应条件，平均剂量从数百到数十万之间收集。普通的聚乙二醇分子两端都有一个羟基。如果一端用甲基密封，则获得聚乙二醇单烷基（mpeg）的异构甲基结合物。在计算氨基酸和蛋白质聚乙二醇（peg）的过程中，使用最多的是mpeg衍生物。 PEG: HO —(CH2CH2O)n—CH2CH2—OH mPEG: CH3O —(CH2CH2O)n—CH2CH2—OH 蛋白质的聚乙二醇化修饰研究始于二十世纪七十年代,最初的目的主要是为了降低蛋白质类药物的免疫原性.进一步的研究表明,蛋白质经聚乙二醇化修饰后还可以改善许多其它方面的性质,如增加蛋白质对酶的稳定性、延长蛋白质在血浆中的半衰期、增加在水中的溶解度等.一些蛋白质的聚乙二醇化修饰物在作为药物的应用中取得了较好的效果.1991年,第一种经聚乙二醇化修饰的蛋白质类药物PEG-腺苷脱氨酶被FDA批准上市,用于治疗一种严重的儿童免疫缺陷症.2001年,用聚乙二醇修饰的干扰素(PEG-INTRON)经FDA批准上市,用于治疗慢性丙型肝炎.多肽与蛋白质在理化性质上具有许多相似之处,肽类化合物的聚乙二醇化修饰研究晚于蛋白质的相关研究,近年来关于肽类化合物的聚乙二醇化修饰研究也取得了一些进展,尤其是肽类化合物在聚乙二醇化定点修饰方面较蛋白类物质更易于实现,因此开展肽类化合物的聚乙二醇化修饰研究也具有较重要的意义. 在多肽的聚乙二醇化修饰研究中应用最普遍的是mPEG,先在mPEG的末端引入羧基、氨基或其它活性基团,或者制备经mPEG修饰的氨基酸衍生物, 再利用固相或液相法将其偶联到肽序列中去,实现对多肽的N端,C端及某些氨基酸侧链的聚乙二醇化修饰.下面主要介绍近年来文献报道关于多肽和蛋白质的聚乙二醇化定点修饰的一些方法. 1 氨基酸的控制 在多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法中,主要是对N末端或赖氨酸侧链氨基进行酰化修饰.因为蛋白结构中通常存在多个氨基,所以控制和确定修饰位点及修饰程度一直是蛋白质的聚乙二醇化修饰中的一个难点.肽类化合物的合成中可以通过采用适当的保护策略来实现对氨基的定点修饰. 1.1 聚乙二醇mpeg的合成 为了实现对肽链中氨基的聚乙二醇化酰化修饰,需要在聚乙二醇上首先引入羧基或活化的羰基.1993年,Lu等首先报道了在固相多肽合成中应用单甲氧基聚乙二醇的羧基衍生物对肽链的N端氨基进行酰化修饰的方法:以mPEG作原料,先合成mPEG—OCH2COOH和mPEG—OCH2CO—Nle—OH,在mPEG中引入一个正亮氨酸(Nle)作为标记是为了便于确定每一个多肽分子上偶联了几个mPEG分子.应用Fmoc固相多肽合成法,先在树脂上合成全保护肽链,当游离出N末端氨基后,以BOP作缩合剂,将mPEG—OCH2CO—Nle—OH作为一个单体偶联到肽链上,然后经三氟乙酸裂解和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得到了平均分子量分别为2000和5000的mPEG修饰N-端的4肽、8肽和12肽,mPEG修饰产物在RP-HPLC分析图谱上呈单一峰,结构经MALDT-TOF-MS分析得到确证.研究还表明,聚乙二醇对三氟乙酸处理稳定,但氟化氢处理时会有部分断裂,故此法不适用于Boc固相多肽合成法(Eq. 1). 虽然mPEG—OH与琥珀酸酐反应可以很容易地得到mPEG—OCOCH2CH2COOH,但此分子中含有对酸和碱都不太稳定的酯键,不适合用于固相多肽合成中.若通过mPEG—NH2与琥珀酸酐反应引入羧基得到mPEG—NHCO～CH2CH2COOH,此类分子具有较好的稳定性,适用于固相多肽合成中.mPEG—NH2可通过购买商品化试剂获得,也可以由mPEG—OH作原料合成.在mPEG—OCH2COOH的合成中应用了丁基锂,反应需在绝对无水条件下进行,而mPEG—NHCOCH2CH2COOH的合成比较容易些(Scheme 1). Lee等以平均分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇甲酰琥珀酰亚胺(SC-mPEG)在弱碱性水溶液中(pH=8)修饰鲑降钙素(sCT),经RP-HPLC分离得到N端、Lys11和Lys18侧链氨基分别被聚乙二醇酰化修饰的三种产物,产物结构经酶解和质谱分析得到确证,它们在大鼠肾脏匀浆中的半衰期分别为125.5, 157.3和281.5 min,比sCT在大鼠肾脏匀浆中的半衰期(4.8 min)显著增加.用相同的方法,Lee等以平均分子量为3400的SC-mPEG对表皮生长因子(EGF)进行修饰,经RP-HPLC分离到N端、Lys28和Lys48侧链氨基分别被聚乙二醇酰化修饰的三种产物.生物活性测定表明,N端修