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核酸类制品的分离纯化方法 核酸（nucleic acid）分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA主要存在细胞核的染色体中，RNA主要存在于细胞质中。RNA按结构和功能又分为核糖体RNA、信使RNA、转运RNA。 磷酸 D-2-脱氧核糖 核酸 核苷酸 戊糖 核苷 D-核糖 碱基 嘌呤 嘧啶 核酸： 核酸及其衍生物类药物属于结构复杂的一类天然大分子生物制品常采用生物材料为原料，再经预处理、提取和纯化等工艺制造而成；而对于部分衍生物，他们属于小分子，并且结构简单的化合物，可采用化学合成的方法；对于某种单核苷酸，目前最常用的方法是通过微生物发酵法来生产。 核酸类药物可分为两类： 一类是具有天然结构的核酸类药物，这类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，修复受损的组织，所以广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎和肌肉萎缩等疾病。 另一类核酸药物为天然核酸的类似物或衍生物，这类药物具有干扰肿瘤、干扰病毒代谢的功能。因此在治疗艾滋病和肿瘤方面有一定的疗效。 提取核酸的一般原则： 先用各种方法破碎细胞、提取核蛋白，使其与其他细胞成分分离；然后除蛋白（苯酚、去垢剂—十二烷基磺酸钠或蛋白酶），重复几次后获得的核酸溶液，再用乙醇等使其沉淀。 制备具有生物活性的大分子核酸的要求： 必须采取温和的制备条件，避免过酸、过碱的反应环境和剧烈的搅拌，以及防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作。 分离： 苯酚法 氯仿-异戊醇法 SDS法 将蛋白质变性，使核酸与蛋白质分开 苯酚法： 优点：操作条件比较温和、能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性、可得到具有生物活性的高聚合度的核酸 缺点：操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次，费时，而且得到的核酸仍有部分降解。 1、取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min,再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。 2、置冰浴中分层，在0~4℃低温环境下，10 000r/min 离心10min.吸出上层清液，转入新的Eppendorf 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10 000r/min 离心5min。 3、吸出上层清液，转入另一新Eppendorf 管，加2 倍体积95%乙醇（含2%乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。 4、再以10 000r/min 离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。 5、倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。 6、RNA 制品纯度的测定及RNA 提取率的计算与浓盐法相同。 1.盐析法及沉淀法 2.离心法 3.膜分离法 纯化： 把这两种方法结合起来使用，一般是在起始的分离中。 优点：设备简单、应用范围广、沉淀易过滤。 例：在RNA制备中，一般是先捣碎组织，然后制成匀浆，待用氯化钠溶液提取出核糖核蛋白后，再调节到Ph4.5以沉淀各种核蛋白，而后用乙醇沉淀法、盐酸胍和去污剂提取法、酚抽提法分离蛋白质和RNA。 盐析法及沉淀法： 广泛应用于核酸类生物制品的分离方法。 例：在胞二磷胆碱的提取中，需要离心出去菌体，而在生产转移因子时，以离心法除去细胞碎片。 分离法： 此法包括透析、微孔过滤和超滤等。 膜的孔径有很多种，一般在0.0001~10微米之间。若分离高分子制成的膜，孔径可控制在0.2~10微米之间，可过滤一般介质不能截留的细菌和微粒。ATP和辅酶A的除菌过程即可采用微孔滤膜技术。 膜分离法：