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菜蛾变形孢虫孢子分离纯化方法的研究 变形头虫是吉林省农业科学院植物系研究人员从晓草科中分离出的一种微生态学昆虫。研究证明,该种孢虫对小菜蛾有较强的致病性和传播性。为了进一步进行菜蛾变形孢虫的生理生化及分子生物学研究,需要找出纯化孢子的有效方法。本文参照文献报道的本属其它种类及不同属微孢子虫纯化方法,采用差速离心和密度梯度离心方法对小菜蛾变形孢虫孢子进行了分离纯化研究,以确定纯化该种孢虫的最佳方法。 1 材料和方法 1.1 大量繁殖繁殖 微孢子虫:菜蛾变形孢虫,由吉林农业大学植保系从小菜体内分离出,用亚洲玉米螟进行大量繁殖。 试剂:Percoll,瑞典 Pharmacia公司产品 主要仪器设备: 北京医疗仪器修理厂生产的LXJ-64-01离心机 德国eppendorf 出品的Minispin台式离心机 SORVALL RC5C plus 高速离心机 1.2 实验方法 1.2.1 饲养、饲养 用少量浓缩孢子液涂抹亚洲玉米螟黑头卵,幼虫孵化后接入人工饲料,在25±1℃ L:D=16:8条件下饲养20-22天,至幼虫老熟,收获孢子。 1.2.2 除杂剂、过滤滤液、rpm液 将病虫去除表皮及中肠内容物,放入组织研磨器中研磨匀浆,匀浆液用160目铜网过滤,滤液用3000rpm离心15min,去其上清液,剔除杂质。将沉淀重新悬于蒸馏水中,离心洗涤数次,至上清液基本澄清,得到孢子粗提液。 1.2.3 纯度sid测试 将孢子液稀释后用血球计数板分别数孢子数及杂质数,或直接计数5个视野的孢子数和杂质数,求出孢子纯净度。 1.2.4 微丝虫纯度 1.2.4. percoll水溶液 根据文献报道及Percoll的性质设如下处理: (1) 50%Percoll水溶液(v/v,下同)+孢子悬液充分混匀,3000rpm, 离心20min。 (2) 50%Percoll 0.15M NaCl溶液+孢子悬液充分混匀,3000rpm, 离心20min。 (3) 50%Percoll 0.25M蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,3000rpm, 离心20min。 (4) 30%Percoll水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g, 离心20min。 (5) 50%Percoll水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g, 离心20min。 (6) 70%Percoll水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g, 离心20min。 (7) 30%Percoll NaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g, 离心20min。 (8) 50%Percoll NaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g, 离心20min。 (9) 70%Percoll NaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,10,000g, 离心20min。 (10) 30%Percoll 蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,25,000g, 离心20min。 (11) 50%Percoll 蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,25,000g, 离心20min。 (12) 70%Percoll 蔗糖溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,25,000g, 离心20min。 (13) 70%Percoll NaCl溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,8,000g, 离心20min。 (14) 70%Percoll 水溶液+孢子悬液充分混匀,4℃,8,000g, 离心20min。 (15) 30%,50%,75%Percoll水溶液非连续密度梯度离心,4℃,10,000g, 离心20min。 (16) 30%,50%,75%Percoll NaCl溶液非连续密度梯度离心,4℃,10,000g, 离心20min。 (17) 50%Percoll NaCl溶液,在液面上轻加入1-2ml孢子悬浮液,4℃,10,000g, 离心25min,与孢子悬液同Percoll充分混匀的做比较。 1.2.4. 非连续密度梯度 用30%、40%、50%、60%蔗糖溶液(W/W)制成非连续密度梯度液,将孢子悬浮液1ml左右轻铺于梯度液顶层,4000rpm离心1.5h。 1.2.4. 离心液铺设工艺 Percoll及蔗糖均按正梯度铺置密度梯度,即最高浓度液置最下层,向上浓度依次降低。铺制方法为:先将最低浓度的离心液置于离心管内,将一根细长的滴管轻轻插入到离心管底,用注射针依次慢慢推入较高浓度的离心液。最后推入的离心液浓度最高,轻轻抽出长滴管,若各不同浓度溶液间分层清晰,溶液即铺设成功。 加样:用注射针加样,针头和离心管成45-60°角,慢慢将样品沿管壁铺到梯度离心液液面上。 1.2.4. 4.4离心后样品的回收 进行密度梯度离心后,将出现多条带,用长颈细吸管分别仔细吸取各层的分离物,用蒸馏水离心洗涤,去掉离心介质,镜检各层分