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黄酮类药物与牛血清白蛋白相互作用研究 血清是人和动物血清中最丰富的蛋白质，与各种带正、负电负荷物质和电中性材料相互作用。各种药物进入人体首先与血清白蛋白结合, 通过血浆的存贮和运输, 到达受体部位产生药理作用。测定血清白蛋白的变化, 可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此, 从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子间的相互作用目前已成为药物领域的研究热点之一。荧光光谱法是研究生物大分子, 特别是蛋白质与各种有机小分子、离子或无机化合物相互作用的重要手段。通过荧光光谱技术可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息, 同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。 黄酮类化合物是指以黄酮 (2-苯基色原酮) 为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物, 也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。黄酮类化合物大多数具有药理活性, 木犀草素、芹菜素和葛根素均属于黄酮类药物, 结构式见图1。 本工作通过荧光光谱方法研究了木犀草素、芹菜素和葛根素3种黄酮类药物与牛血清白蛋白 (BSA) 间的相互作用, 探讨了其与BSA作用的机理、荧光猝灭常数以及与BSA作用的结合常数和结合位点数等信息。 1 试验部分 1.1 配制0.0.0.0.0.5%10-1的缓冲溶液,在溶液中混溶。请如下做法 RF-5301型荧光分光光度计;TB-85型恒温水浴;pHSJ-4A型pH计。 牛血清白蛋白 (BSA) 标准储备溶液:称取牛血清白蛋白 (相对分子质量为65 000) 0.650 0 g, 加5 g·L-1氯化钠溶液溶解, 定容至100 mL容量瓶, 浓度为1.0×10-4mol·L-1。 三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (Tris-HCl) 缓冲溶液:用0.20 mol·L-1Tris和0.10 mol·L-1盐酸在试验温度下用0.50 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至7.40。 木犀草素、芹菜素、葛根素标准溶液:用TrisHCl缓冲溶液为溶剂配成1.0×10-3mol·L-1, 在0~4℃冰箱中保存。 所用试剂均为分析纯, 水为双重蒸馏水。 1.2 荧光光谱测定 在10 mL比色管中依次加入pH 7.40的TrisHCl缓冲溶液2 mL, 1×10-4mol·L-1BSA溶液1 mL, 以及一定量木犀草素、芹菜素、葛根素标准溶液, 用水稀释至刻度混匀, 在试验温度下恒温1 h, 采用1 cm石英比色皿, 选择激发波长为285 nm绘制荧光光谱, 以及Δλ为60 nm或15 nm同步荧光光谱, 木犀草素与葛根素荧光测定中激发和发射通带均为5 nm, 测定芹菜素激发和发射通带为3 nm。 2 结果与讨论 2.1 谱图的建立 按试验方法分别测定了木犀草素、芹菜素和葛根素浓度对牛血清白蛋白荧光光谱的影响, 荧光光谱图见图2。 由图2可知:随着木犀草素、芹菜素、葛根素浓度逐渐增大, 牛血清白蛋白的荧光强度均逐渐降低, 这是由于蛋白质中存在的色氨酸和酪氨酸, 使其具有内源荧光, 加入的外源性药物木犀草素、芹菜素及葛根素与BSA之间产生相互作用导致BSA内源荧光强度有规律地降低。 2.2 荧光加强研究的静态猝灭类型 引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程。 式中:F0和F分别为不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度;[Q]为猝灭剂的浓度 (mol·L-1) ;KSV为动态猝灭常数 (即Stern-Volmer猝灭常数, L·mol-1) ;Kq是由扩散过程控制的双分子动态荧光猝灭速率常数 (L·mol-1·s-1) ;τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命, 生物大分子荧光平均寿命约为10-8s。 静态猝灭过程遵循下式关系: 式中:Ks为静态猝灭常数 (即配合物的缔合常数) 。随温度的升高动态猝灭常数增大, 而静态猝灭常数减小, 可由此判断荧光猝灭类型。 在不同的温度下, 以F0/F对相应的[Q]作图, 可得到木犀草素、芹菜素、葛根素对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程及猝灭常数, 见表1。 一般认为, 各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数为2×1010L·mol-1·s-1, 而从表1结果可知:木犀草素、芹菜素和葛根素对BSA荧光猝灭的猝灭速率常数Kq数量级均在1012以上, 可以初步判断加入木犀草素、芹菜素及葛根素导致BSA荧光猝灭过程是以静态猝灭为主, 又随温度升高Stern-Volmer方程的斜率减小, 进一步表明该过程是以静态猝灭为主。 2.3 f0-f/f对lg[q]的双对数图 当小分子与大分子结合时其表观结合常数Kb与结合位点数n由下式求出: 分别在292 K, 311 K温