1株去氢表雄酮-三羟基雄甾烯酮的诱变选育.docxVIP

1株去氢表雄酮-三羟基雄甾烯酮的诱变选育 三羟基雄烯酮（7，15，二羟基二醇）是合成化疗抗癫痫药物的重要中心。Yasmin是最早由先灵公司开发成功的口服避孕药。生物转化被认为是解决甾体非活性碳原子特异性氧化的最有效方法。微生物能在甾体母核或侧链基团上特异性地加入一个或两个羟基, 甾体的羟基化是合成具有生物活性甾体衍生物的最重要方法之一。利用微生物的P450羟化酶系统能将去氢表雄酮 (DHEA) 双羟基化合成7α, 15α-di OH-DHEA。 据文献报道, 丝状真菌具有将DHEA转化为7α, 15α-di OH-DHEA的能力, 例如尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum VKM F-1600和亚麻刺盘孢Colletotrichum lini。当DHEA的浓度为2 g/L时, 尖孢镰刀菌的7α, 15α-di OH-DHEA摩尔得率达到63%。虽然Romano等发现亚麻刺盘孢的DHEA浓度为2.5 g/L时, 7α, 15α-di OH-DHEA的摩尔得率提高到69.8%。但仍然存在底物投料浓度低、产物得率不高的问题, 必将限制着7α, 15α-di OH-DHEA的工业化应用。因此有必要对转化菌株进行选育和工艺优化, 从而进一步提高甾体DHEA的转化效率。 目前在高效菌株的选育中, 诱变育种是普遍应用并十分有效的方法, 但由于甾体类转化的微生物大多数为霉菌, 采用传统的菌丝体诱变方法较难达到预定的诱变效果。因此, 在了解菌株细胞结构特征的基础上, 采用单孢子或原生质体诱变并结合特定的筛选方法选择效果最佳。本实验室前期筛选得到一株将DHEA转化为7α, 15α-di OH-DHEA的赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1, 但其DHEA的转化能力仍然不高。本文采用亚硝基胍 (NTG) 化学诱变结合酮康唑筛选方法对赤霉菌孢子进行诱变, 提高筛选效率, 并对高效突变菌进行转化工艺优化, 从而进一步提高突变菌的转化效率。 1 材料和方法 1.1 蘑菇 赤霉菌 (G.intermedia CA3-1) , 由本实验室筛选保藏。 1.2 kh2po2 斜面固体培养基 (g/L) :葡萄糖10, 酵母粉7.5, Na Cl 1.16, KH2PO42.72, 琼脂2%, 自然p H。 种子培养基 (g/L) :葡萄糖10, 酵母粉7.5, Na Cl 1.16, KH2PO42.72, 自然p H。 原始转化培养基 (g/L) :葡萄糖10, 酵母粉15, 玉米浆6, 初始p H 7.0。 1.3 式摇床培养 将种子液按6%接种量转接到转化培养基中, 组合式摇床220 r/min、28℃培养24 h。向已培养24 h转化液中投入5 g/L DHEA, 继续转化72 h。 1.4 诱导突变育种 1.4.1 子悬液的制备 按照参考文献制备孢子悬液, 最终孢子悬液的浓度为1×106个/m L左右。 1.4.2 强制变评价模型的构建 按照卢文玉等报道的方法确定酮康唑对赤霉菌的最小抑制浓度。 1.4.3 盐水液混合均调液ld50 将NTG分别用孢子悬液稀释到浓度0.12 mg/m L, 混合均匀并处理30 min时间后, 用生理盐水稀释10–5倍。分别吸取100μL稀释液并涂布在酮康唑抗性筛选平板上, 定时观察并计数。 1.4.4 初筛和复筛 挑取筛选平板中长势较好的单菌落, 转接到平板中分离活化, 进行平板初筛;继而接种于摇瓶初始转化培养基中, 进行复筛。对转化能力较强菌株进行反复筛选, 筛选得到稳定的高效突变菌株。 1.5 分析 1.5.1 生物量的测量 将转化液离心去上清得菌丝体, 用去离子水重复洗涤2~3次, 105℃烘箱烘干至恒重。 1.5.2 色谱柱及色谱柱 按照参考文献制备高效液相色谱样品。HPLC条件采用Agilent TC-C18 (4.6 mm×250 mm, 5μm) 色谱柱, 流动相为乙腈/水 (7:3, V/V) ;柱温:30℃, 检测波长:206 nm, 流速:0.5 m L/min, 进样量10μL。 1.6 培养基培养基的添加量:碳源、氮源、教学物质中添加合适浓度的无机溶剂浓度对产物浓度的影响,未充 培养基组分的优化:以转化培养基为基本培养基, 采用单因素优化方法, 保持其他成分浓度不变, 仅改变碳源、氮源的浓度及添加适宜浓度的无机盐, 考察其对产物浓度的影响, 获得最佳培养基。 p H的优化:分别调配不同初始p H (5.5、6.0、6.5、7.0、7.5) 的培养基, 考察初始p H对产物合成的影响, 以确定最适初始p H值。 2 结果与分析 2.1 氧或底物抑制 酮康唑为一种细胞色素P450抑制剂, 是血红素的配体, 能与P450竞争分子氧或底物抑制P450酶活。能耐受酮康唑最