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免疫金标记技术的研究 免疫金标记是一种将金溶胶用作标记的新免疫标记技术。该技术简单易用。已经成为继荧光素、酶和阴离子等标记技术之后的一种新检测技术。金标抗体检测将反应载体和信号输出融为一体，其稳定性和柔软性决定了检测方法的稳定性和检测限制。我们是基于研究纳米颗粒和受体之间的相互作用，确定了阐明这些相互作用的机制，为提高该方法的灵敏度和稳定性奠定了基础。 本文以纳米金溶胶和AFB1单克隆抗体McAb为材料, 研究了标记过程和标记条件, 获得了稳定、 灵敏的免疫金标AFB抗体探针. 并且通过透射电镜、 紫外-可见光谱、 红外光谱、 圆二色谱、 荧光光谱等手段分析了标记前后金溶胶和抗体蛋白的结构和构象变化, 为揭示纳米金与抗体蛋白之间的作用机理提供突破点. 1 实验部分 1.1 仪器和检测方法 Spectronic 1.70 GBC紫外-可见光分光光度计(意大利), Hitachi H7000, 透射电镜(日本), RCT IKA磁力搅拌器(德国), Nicolet 5DXC红外光谱仪(美国), 岛津RF-5301PC荧光光谱仪(日本), J-500C圆二色谱仪(德国), Centrikon T-124高速冷冻离心机(瑞士). 1.2 实验过程 1.2.1 金溶胶抗体蛋白实际用量的测定 向5 mL金溶胶溶液中加入1 mL不同浓度的抗体蛋白溶液, 充分混匀. 5 min后加入质量分数为10%的氯化钠溶液1 mL, 然后分别测定520 nm和580 nm的吸光值A, 以A520-A580为纵坐标, 蛋白质用量为横坐标作一曲线, 取曲线拐点处的蛋白质用量为最小保护剂量, 在此基础上再加20%为稳定金溶胶的抗体蛋白实际用量. 1.2.2 金溶胶的纯化 取一定体积的金溶胶溶液, 在磁力搅拌的同时, 缓慢滴加0.1 mg/mL McAb溶液(将McAb 溶于0.01 mol/L pH=7.4 的PBS缓冲液中). 金溶胶的浓度为[Au]=2.4×10-5mol/L. 静置0.5 h后通过2次4 ℃冷冻和超速离心进行纯化. 首次离心转速10000 r/min, 时间45 min, 弃去上清液, 沉淀用质量分数为10%的BSA溶液溶解, 进行第二次离心; 第二次用质量分数为10%～30%的甘油密度梯度离心, 转速7000 r/min, 时间45 min, 用于除去未标记的蛋白和金颗粒聚集体, 收集中间红褐色部分备用. 1.2.3 纳米金颗粒物理性能 对获得的纳米金抗体复合物进行TEM 测试, 测定纳米金颗粒复合物的颗粒形态、 直径和均匀度, 用统计学处理所测的50个金颗粒, 计算平均直径和标准偏差. 1.2.4 mcab抗体的免疫活性测定 采用间接竞争ELISA方法测定McAb抗体标记前后的效价和亲和常数. 稳定性分析根据不同贮藏时间(常温, 25 ℃)McAb抗体的免疫活性保存率来评价. 以ELISA阴性孔(不含AFB1)和阳性孔(AFB1质量浓度为1 ng/mL)吸光度差值表示McAb抗体的免疫活性. 贮藏过程中, 测定值与初始值之比为免疫活性的保存率(%). 每10 d测定一次, 共贮藏60 d. 1.2.5 荧光光谱的测定 固定McAb的量, 加入不同浓度的纳米金溶胶(Au浓度介于3～30 μmol/L之间), 检测体系的荧光光谱. 所用的激发和发射光谱带宽均为1.5 nm, 狭缝宽度为1 nm, 激发光波长为280 nm, 测得荧光发射光谱, 再以Δλ=15 nm和Δλ=60 nm测定样品的同步荧光光谱. 1.2.6 色谱分析测试 分别对McAb和McAb与纳米金溶胶复合物进行圆二色谱分析, 测试范围190～300 nm, 测试温度25 ℃, 扫描速度100 nm/min, 扫描步长0.1 nm, 扫描带宽1.5 nm. 2 结果与讨论 2.1 最佳ph值及用量的确定 金溶胶在500～550 nm之间有强的吸收峰, 是金纳米粒子的表面等离子体共振吸收峰. 由图1可知, 随着McAb加入量的逐渐增加, 在520 nm附近的等离子体吸收峰的强度逐渐降低, 推测McAb与金纳米粒子发生了相互作用. 当McAb量逐渐增多时, 吸收峰降低并逐渐平缓, 这表明抗体上的金颗粒结合位点达到饱和. 图2显示, 与McAb作用后, 前5 min内的金溶胶等离子共振吸收峰降低最明显, 5 min后趋于稳定, 作用16 h时, 吸收光谱仍没有明显变化. 表明McAb与金纳米粒子之间的作用在5 min内基本完成, 并且作用后的结合物相对稳定. 不同pH(pH=4.5, 6.0, 7.5, 8.0, 9.0, 10.0)条件下, 金纳米粒子与McAb蛋白作用后, 其共振吸收峰降低的趋势与280 nm的吸收峰升高的趋势是一致的, 除了pH=4.5时的共振吸收峰发生大