马铃薯卷叶病毒的提取纯化研究.docxVIP

马铃薯卷叶病毒的提取纯化研究 由马蹄卷叶病毒（plfv）引起的甘薯黄疸、低度收缩、卷叶、僵硬和块状坏死。这是大多数甘薯病的类型。我国南、北方一些马铃薯主要栽培品种均感染有此病毒病。由于PLRV严格虫传,主要存在于寄生植物维管束韧皮部细胞中,难于大量提纯等原因,长期以来这一病毒的研究进展缓慢。 提取PLRV最早成功之例是1967年Peters从蚜虫体内获得了少量纯化的PLRV粒体。1969年Kojima第一次成功地从感病洋酸浆组织中提取到了较多的PLRV粒体。其后Murayama和Kojima,Sarkat,Maat和Debokx,Gugerli,Smith,Takanami等分别从马铃薯或洋酸浆组织中部分纯化了PLRV。他们的纯化程序大致都是将病组织于缓冲液中匀浆,以氯仿-正丁醇混合物变性植物蛋白,一次PEG沉淀病毒,而后经一次或两次差速离心,最后用蔗糖密度梯度离心分离。 由于PLRV存在于植物的韧皮部细胞中,按照常规的粗汁液提取方法不一定能将植物组织韧皮部细胞中的病毒充分提取出来,Takanami等将植物组织于28℃的条件下用酶消化,从而使病毒充分地释放出来,得到大量的PLRV。但是由于提取过程中要将植物组织和酶于28℃下作用两小时,这样对提取到的PLRV活性难免有一些影响。 在病毒的粗提过程中,为了提高病毒的纯度,一些学者采用两次激烈的蛋白变性剂去除植物蛋白,这或多或少会影响病毒的产量。为制备大量高效价的特异性多克隆及单克隆抗血清,进一步研究病毒的化学组分,或分离病毒的基因组,都需有足够量的高纯度病毒制剂。我们在Smith,Kojima以及Sarkar等提纯方法的基础上,采用液氮冷冻、一步提取法彻底破碎植物组织细胞,以充分释放病毒,采用Sephadex G-200分子筛过滤法初步纯化PLRV;再用蔗糖密度梯度离心进一步提纯,提高了病毒的产量和纯度。初步建立了一个改进的、行之有效的马铃薯卷叶病毒提纯程序。 制备冷-1-pb-1-双酰甲基-1,3,5.2.3.4和5.2%基乙醇2.2.2.2.2.2.4和5.2.4.4.4冷液、5.4.4.4和5.4.4.4.4和5.4.4.4.4和5.4.4.4.4.4和5.4.4.4.4.4.4.5%peg分离. PLRV来源于内蒙古大学温室中保存的马铃薯.此病毒系张鹤龄等从马铃;292-20分离鉴定的. 用桃蚜(Myzus persicae)作为传毒媒介.此蚜虫系春季采自桃树上,并转接到萝卜或白菜上增殖.待幼蚜繁殖出来时立即转接到另外的无毒白菜或萝卜上增殖,用于饲毒. 用洋酸浆(Physalis floridana)作为增殖材料.将在白菜或萝卜上增殖的无毒无翅蚜虫,转到上述感染有PLRV的马铃薯小苗上饲毒3天,再转接到洋酸浆幼苗上,每株幼苗接种3～5头,传毒3天,而后以杀虫剂杀死蚜虫.将传毒后的植物于23～30℃的温室中培养20～30天,待出现典型的病症时收集材料,冻存于-20℃备用. 主要参照Smith的提纯方法,取上述冻存病源材料500g,加入2 000 ml冷的0.5M pH7.4的PB,内含10mM/1 EDTA和0.1%巯基乙醇,于搅肉机上搅碎两次,组织匀浆器上匀浆,两层纱布滤渣.于汁液中加入三分之一汁液体积的冷氯仿-正丁醇(1:1)混合物,在冰浴中搅拌乳化1小时,4.C静置1小时,3 500r/min离心25分钟澄清.于上清中加入7%(W/V)PEG(MW6 000)置4.C2小时.9 000r/min离心30分钟收集沉淀.以1/3原汁液体积冷的0.07M,pH7.4 PBk回溶,9 000r/min离心12分钟以澄清.于上清液中再加入7%PEG和2%NaCl进行二次PEG沉淀,同上收沉淀及澄清。 将上述澄清液加在含有20%蔗糖垫层的离心管中(5ml/管),31 000 r/min(MSE-75,8×50ml)离心2.5小时,沉淀回溶于0.07M pH7.4 PBk中,9 000 r/min离心15分钟澄清,其上清再加于含于20%蔗糖垫层的离心管中(1ml/管),46 000 r/min离心3小时,回溶沉淀于0.07M pH7.6 PBk中,高速离心澄清. 将差速离心后得到的病毒悬液(不超过2ml)加在装有水冷系统的、事先以0.07M pH7.4 PBk (含0.1%NaN,)平衡的Sephadex G-200柱上,进一步分离纯化(柱高50cm,直径1.5c).洗脱液同平衡液,收集1ml/管. 将两次差速离心之后得到的病毒悬液,进行蔗糖密度梯度离心.梯度为10～40%蔗糖,用0.01M pH7.5 PBk配制,于MSE-75离心机上(3×4ml水平转头)30 000 r/min离心2.5小时. 把上述500g感染有PLRV的酸浆经提取后的剩渣,用纱布包好放液氮冷冻,而后取出