基因工程的酶学基础(共137张PPT).pptxVIP

第二章基因工程的酶学基础 一、限制性核酸内切酶第一节 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restriction endonuclease）相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二脂键 2. 性质内切酶。原核生物，少数霉菌和蓝藻。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自我保护作用。3. 功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1. 来源 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）① Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基② Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基 在甲基化酶的作用下，从给体分子S—腺苷甲硫氨酸，转移给限制酶识别序列的特定碱基 I 型限制性内切酶 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 1、内切酶和甲基化作用是分开的2、内切序列特异性 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。（1）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. I型限制性内切酶 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。N：表示任何一种核苷酸 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）（3）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 （1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关2. II类限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind Ⅱ 回文结构：指的是形似回文的一段DNA序列，其特点有二：1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5/ 3/），其核苷酸顺序相同如： 5′···GTATCC GGATAC···3′ 3′···CATAGG CCTATG···5′ （2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：识别位点处。 （3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：① 5’端凸出（如EcoR I切点）G?AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA?G5’--3’ 3’--5’ 5’--3’ 3’--5’ 从 5’-P末端切割双链DNA的两链，产生5’-P单链延伸的黏性末端 CTGCA?G ② 3’端凸出（如Pst I切点）G?ACGTC 5’--3’ 3’--5’ 5’--3’ 3’--5’ CTGCA G G ACGTC 在其识别序列的对称轴两侧，从 3’-OH 末端切割双链DNA的两条链，产生具有 3’-OH 单链延伸的黏性末端。 ①连接便利 （4）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。 ③ 补平成平齐末端凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。② 5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 1、 同裂酶（Isoschizomers)：来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。 （5）II型限制酶的一些特殊性质① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。Hind Ⅲ 5’-A?AGCTT-3’ 3’-TTCGA?A-5’ Hsu I 5’-A?AGCTT-3’ 3’-TTCGA?A-5’ 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。② 不完全同裂酶： 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 5’-G?GATCC-3’ 3’-CCTAG?G-5’ BamH IBcl I5’-T?GATCA-3’ 3’-ACT