消痞颗粒对实验性慢性萎缩性胃炎胃黏膜bcl-2和bax表达的影响.docxVIP

消痞颗粒对实验性慢性萎缩性胃炎胃黏膜bcl-2和bax表达的影响 慢性萎缩性胃炎（cag）由于不典型的增生（pd）而发病率很高，但对其治疗没有影响。除了对其进行密切的护理和手术外，现代医疗之外，没有其他方法可以更好地治疗神经退行性胃炎。临床实践表明,中医中药治疗取得较为满意的效果,显示了其广阔的发展前景。在成功建立CAG伴ATP动物病理模型的基础上,已有研究观察了中药消痞颗粒剂对CAG伴ATP大鼠胃黏膜组织形态、生化及银染核仁形成区(silver-staining nucleolar organizer region ,AgNOR),癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)及ras癌基因表达产物rasP21的影响,笔者进一步探讨其对大鼠胃黏膜Bax和Bcl-2表达的影响,从蛋白质水平进一步探讨CAG伴ATP发生机制及中药防治的有效机制,为临床用药提供一定的实验依据。 1 材料和方法 1.1 大鼠分组及模型建立 雄性Wistar大鼠60只,体重260～280 g,由维通利华公司提供,随机将大鼠分为5组:正常组,病理模型组,自然恢复组,消痞颗粒剂治疗组,阳性对照(维酶素)组,每组12只。 1.2 开腹弹簧内固定 参照文献方法,大鼠禁食不禁水24 h后,以3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹腔麻醉。在无菌条件下开腹,在腺胃距胃幽门环0.2 cm处切小口,将一长约2 cm的金属弹簧一端插入幽门环,并用缝线将弹簧两端固定。按手术常规逐层缝合胃及腹壁切口。手术1周后,每周给每只大鼠分别灌胃2次高盐热淀粉糊(60～70℃,含10%氯化钠),每次2 ml,至实验第16周结束,将模型组动物处死,取材固定。 1.3 维酶素混悬液组消嗪颗粒 消痞颗粒剂12 g/袋,主要由党参、炙百合、乌药香橼皮、丹参、三七粉、莪术、蒲公英、白花蛇舌草等药组成,由北京中医药大学东直门医院制剂室制成冲剂。维酶素由北京长城制药厂生产,其主要成分为多种维生素、氨基酸及微量元素。消痞颗粒组给予消痞颗粒剂0.5 ml/(100 g·d)(浓度为0.6 g/ml)灌胃,自然恢复组给予蒸馏水0.5 ml/(100 g·d)灌胃,阳性对照组给予维酶素混悬液0.5 ml/(100 g·d)(浓度为0.04 g/ml)灌胃。以上各组均于造模完成后开始灌胃,每周6 d,共12周,至实验第28周结束。 1.4 样品采集和样品处理 实验结束后,取大鼠胃组织固定于10 %甲醛中,常规取材,石蜡包埋,连续切片,切片厚4～5 μm。 1.5 mmunstab和dab 兔抗Bax多抗、兔抗Bcl-2多抗,免疫组化试剂盒(Immunostain SP Kit)为美国Santa Cruz公司产品;DAB为美国Sigma公司产品;抗Bax多抗、抗Bcl-2多抗浓度均为1∶300,以TBS稀释。 1.6 疫组织化学法检测bax和bcl-2染色 常规苏木精-伊红染色,链酶亲和素-过氧化物酶复合物(streptavidin peroxidase Conjugate SP)免疫组织化学法分别进行Bax和Bcl-2染色。染色步骤:切片脱蜡至水,3% H2O2封闭内源性过氧化酶,磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤,微波修复,PBS洗涤3次,加入非免疫的羊血清封闭非特异性抗原,倾去血清,加入一抗,4℃孵育过夜,PBS洗涤,加入生物素标记的二抗孵育,PBS洗涤,加入过氧化物酶-链酶卵白素孵育,PBS洗涤,DAB显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明、中性树胶封片。 1.7 阳性染色细胞比例检测 1.7.1 Bcl-2 Bcl-2蛋白阳性反应物质呈棕黄色,主要位于腺上皮细胞胞质内,偶可伴核着色,以细胞质或细胞核中出现均匀一致的棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片在高倍镜下观测计数200个细胞,依据镜下阳性染色细胞占计数细胞的比例判定染色结果,采用半定量积分法,即根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅计分,着色细胞比例1/3为1分,1/3～2/3为2分,2/3为3分;着色程度:无着色为0分,浅蓝色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,两者合计统计积分。 1.7.2 Bax Bax蛋白阳性反应物质呈棕黄色,主要位于腺上皮细胞胞质内,偶可伴核着色,以细胞质或细胞核中出现均匀一致的棕褐色颗粒为阳性细胞。先在低倍镜(×4)下确定这些区域,再于200倍(20×10,0.739 mm2/视野)下计数5个视野的阳性细胞数,并求其均数。 1.8 统计处理方法 运用SPSS 10.0软件进行统计分析,计量资料采用ANOVA方差分析、方差齐性检验并进行多重比较。 2 结果 2.1 集体龙眼观察 模型组胃窦黏膜局灶苍白区,粟粒状结节较为多见;消痞颗粒组仍可见局灶苍白区,粟粒结节减少;自然恢复组和维酶素组与模型组相比变化不大。