甜瓜枯萎病防治反应及相关酶活性的变化.docxVIP

甜瓜枯萎病防治反应及相关酶活性的变化 土壤养殖的风险和南瓜萎缩，对生产和工业的危害十分严重。木霉(Trichodermaspp.)是一类普遍存在、已被广泛应用的生防因子。它能对多种病原菌产生拮抗作用,有效地抑制病原菌生长。植物内生细菌由于定殖于宿主体内,有充足的营养来源,不易受外界逆境因子影响,与其它根际细菌、叶际附生细菌相比,其特定的生存环境更利于发挥生防作用,因而成为近年来倍受人们关注的生防因子。研究者们已经从棉花、马铃薯、辣椒、玉米等植物中分离出大量的内生细菌,并对内生细菌的生防机制作了研究。但有关拮抗木霉和植物内生细菌结合防治的研究却不多见。本试验在温室内应用拮抗内生细菌与木霉复合处理甜瓜,从防御酶系的变化分析其诱导甜瓜抗病性的生防机制。 1 材料和方法 1.1 绿色木霉属viruspo型 甜瓜品种为“齐甜一号”。枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis(Ehrenberg) Chon (1872)]B6菌株自甜瓜组织内分离,绿色木霉(Trichoderma viridPers. ex S. F. Gray)T23、甜瓜枯萎病菌[Fusarium oxysporumf. spmelonis(Leach)Syn]F由沈阳农业大学生物防治工程中心提供。 1.2 内生细菌多样性测定 木霉T23在麦麸培养基(麦麸与水按质量分数约1∶1混合,121℃湿热灭菌45min)中25℃恒温培养10~14d后,风干粉碎,以1∶100比例与灭菌土混合。甜瓜枯萎病菌F在玉米粉砂土培养基(玉米粉1000g,洗净的砂1000g,水1500ml)中25℃培养10~14d,风干粉碎,以0.5∶100与灭菌土混合。内生细菌B6在LB培养液中30℃振荡(120r/min)培养48h,制成浓度约2×107cfu/ml的菌悬液。常规种子消毒处理,待芽长约1cm左右时播种。种子播种在灭菌土中,待甜瓜长出3片真叶后,进行接种。用注射器将菌悬液注入植株根围土壤,单独接种的处理每株接种10ml,复合接种的处理B6与T23各5ml,设清水为对照。试验设:①接种F;②接种F和T23;③接种F和B6;④同时接种T23、B6和F,共4个处理。每处理80盆,每盆播2粒种子,每处理3次重复。放入温度约25℃的温室中培养,三叶期调查记录发病情况。 1.3 例如，b2和b23的组合使用对瓜氨酸反应反应酶系统的影响 1.3.1 制备抗血球计数板上的药物 T23和病原菌F在PD液体培养基中28℃振荡(120r/min)培养7~10d,血球计数板调整孢子浓度,制成5×106cfu/ml(T23)和1×106cfu/ml(F)的孢子悬液。 1.3.2 接收点3和s13 种子处理和接种方法同1.2。诱导接种后72h挑战接种F菌株,试验共设8个处理:①CK(自来水);②接种T23;③接种B6;④接种T23后,挑战接种F(T23+F);⑤接种B6后,挑战接种F(B6+F);⑥同时接种T23和B6(T23+B6);⑦同时接种T23和B6后,挑战接种F(T23+B6+F);⑧单独接种F。 1.3.3 不接种、挑战接种f的处理 取甜瓜根用自来水快速冲洗后,用滤纸吸干,每个样品称取1g装入自封袋,放入-70℃超低温冰箱中保存。每个处理3次重复取样。不接种F菌株的处理从接种后开始每隔48h取一次样,至接种后的第8d;挑战接种F的处理从接种F菌株后每隔48h取一次样,至挑战接种的第8d。将上述称取的样品,放入预冷的研钵中,加入3ml硼酸缓冲液(含有少量巯基乙醇)和少量石英砂,冰浴研磨成匀浆,转移至离心管中,10000r/min、4℃离心20min,所得上清液即为酶的粗提取液,4℃保存。 1.3.4 酶法制备酶系统,-1,3-葡聚糖酶 苯丙氨酸解氨酶(PAL)以L-苯丙氨酸为底物,按贾显禄的方法测定,有改动;过氧化物酶(POD)以愈创木酚为底物,参照陈捷等的方法测定;多酚氧化酶(PPO)以邻苯二酚为底物,参照李靖等的方法测定;β-1,3-葡聚糖酶以葡聚糖为底物,按高增贵、贾显禄方法测定。酶粗提液及未知样蛋白含量的测定参照Broadford方法,用考马斯亮蓝G-250法测定酶粗提液中的蛋白含量,以牛血清白蛋白作标准曲线。 2 结果与分析 2.1 不同菌株单独和复合处理对抗性相关系数的影响 在温室内,B6和T23复合处理对甜瓜枯萎病的相对防效达82.22%,而B6菌株和T23菌株单独处理相对防效分别为61.90%和33.33%,复合处理比单独处理分别高32.8%和146.7%(表)。 2.2 不同复合接种对甜瓜根系pod活性的影响 2.2.1 PAL活性 T23、B6、T23+B6诱导接种甜瓜幼苗后,PAL活性高于对照,但各处理间差异不大(图1A)。单独接种T23后酶活性逐渐上升,8d峰值达到2548.