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绿木霉对水稻纹枯病菌的拮抗作用及机理 0 抗病品种的应用 [研究意义]水稻阴道腐败和水稻栽培是三种水稻疾病中的两种。水稻纹枯病是由立枯丝核菌[Rhizoctonia solani,teleomorph:Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk)]引起的。该菌产生的菌核结构具有抗逆性、忍耐极端环境条件的能力,这些特性使其在病原菌的存活和传播中起着关键作用,也使该病害成为生产上最难防治的病害之一。而稻瘟病病原菌小种复杂多变,难以获得对多种病原小种都有广普抗性的水稻品系,生产上仍然以药剂防治为主。近年来,由于杂交水稻和籼粳交育成的高产品种的推广以及氮肥用量不断加大,稻曲病的发生日趋严重,已从次要病害上升为主要病害,而针对该病害的抗病育种工作尚未开展。利用抗病品种防治水稻病害被公认为是最经济、安全和有效的措施,也是防治三种重要病害最直接的途径。由于水稻抗病育种尚未取得突破性进展,水稻真菌病害主要是采用药剂防治和农业栽培防治相结合的综合防治方法。但长期使用药剂,容易使病原菌产生抗药性,还会因长期大量使用农药造成自然生态环境污染及稻米的农药残留问题。近年来,转基因抗病育种工程已培育出同时抗稻瘟病和纹枯病的水稻新品系,但人们对转基因作物风险性的担忧,使得这些品系迄今还未在生产上广泛使用。井岗霉素是水稻纹枯病的主要防治药剂,但是已经使用了20多年,防治纹枯病的用药量不断提高,现每年使用次数已经从20年前的2次增加到目前的3—4次,使用量也已从1.5 kg·hm-2增加到目前的4.5—6.0kg·hm-2。一旦井冈霉素防治失效,水稻生产将面临巨大的风险,急需有效的新产品替代。【前人研究进展】一些研究表明,木霉菌防治水稻纹枯病具有良好的防治效果,这为防治水稻病害开辟了另外的途径。笔者针对抑制菌核形成筛选出了绿木霉(Trichoderma virens)菌株TY009,通过对其代谢产物进行分离纯化和化学结构分析,其有效生物活性成份被鉴定为胶霉毒素(gliotoxin)(将另文介绍)。同时,该菌株已被EGFP标记,利用其转化子对定殖菌核的机制也进行了深入研究。【本研究切入点】由于该菌株对立枯丝核菌的拮抗作用和应用生防的潜力还没有被评价;再者,胶霉毒素是一种广谱性抗菌素,对多数植物病原真菌有抑制作用,但还未见对稻瘟病菌和稻曲病菌抑制作用的研究报道。【拟解决的关键问题】本文主要研究绿木霉菌株TY009对立枯丝核菌的拮抗作用,以及其代谢产物胶霉毒素对立枯丝核菌菌丝生长和菌核萌发、稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成、稻曲病菌分生孢子萌发和次生孢子形成的抑制作用和对其稳定性进行评价。旨在阐明TY009菌株防治水稻纹枯病、稻瘟病和稻曲病的应用潜力。 1 材料和方法 1.1 抗菌、微生物和培养基 绿木霉菌株(Trichoderma virens)TY009、棘孢木霉(T.asperellum)TG、哈茨木霉(T.harzionum)TC3、哈茨木霉(T.harzionum)NF9(由浙江大学生物技术研究所植物真菌病害与生物防治实验室分离鉴定)保存在-20℃(孢子+17%脱脂奶粉+3 g硅胶颗粒)。立枯丝核菌(Rhizoctonia salani AG1-IA)HZ001(分离自中国水稻研究所试验田间)保存在-70℃(菌片在20%甘油中)。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Guy-11和稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)SXⅡ保存在斜面试管中。 4个木霉菌株在PDA平板上活化,在黑暗25℃条件下培养。稻瘟病菌(M.oryzae)Guy-11的活化和培养在完全培养基(complete medium,CM)上进行。稻曲病菌(U.virens)SX11的活化和培养在PSA(potato sucrose agar)培养基上进行。稻瘟病菌和稻曲病菌产孢在25℃光照交替条件下进行。 1.2 分离、蒸干、纯化 绿木霉菌株TY009在25°C、PDA平板上培养产孢后,1.0 m L制备的孢子悬浮液(1×106)接种到含2 L PDB(马铃薯葡萄糖汁)液体培养基(含有0.1%几丁质)的震荡烧瓶(4 L)中。在25°C摇床(125 r/min)上进行培养。每个处理重复3次。培养10 d后,过滤培养液的有机相用分离漏斗分离、蒸干(RE-52CS旋转蒸发仪),平均每个处理获得粗提物约0.3874 g。合并后的粗提物通过柱层析[流动性为石油醚﹕乙酸乙酯(v﹕v)=2﹕8]分离,再用制备型硅胶板(GF254,0.5 mm)对含有胶霉毒素的组份进行纯化,共获得纯化产物37.53 mg。最后在半制备液相色谱仪[a Waters600 Pre-HPLC,具有Shim-pack Prep ODS柱(20×2cm,I.D,10μm),USA]上进