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香蕉枯萎病菌内生菌的分离及拮抗活性筛选 香蕉萎缩，也称为香蕉耿伊洛伊木马萎缩，是由阻断氨基酸（oxyspormf.c.）引起的。这是一种毁灭性的香蕉真菌病，属于外部检疫对象。该病害在许多国家地区均有发生,近几年在我国危害尤为严重。目前尚未有理想的抗病品种及有效的化学防治方法。生物防治因其既能防治病虫害,又能保护生态平衡,成为人们研究的热点。利用根际微生物及体表微生物防治该病菌已有一些报道,但这些生防菌易受周围环境条件的影响,不易在病原物存在的环境中稳定繁殖,从而严重影响其防效。作为生物防治重要微生物资源之一的内生菌,它具备受外界环境影响小,易于在宿主上定殖,产生抑菌活性物质新颖等特点,因此利用拮抗性内生菌来进行生物防治具有独特的优势。曹理想等首次报道了粉蕉内生放线菌玫瑰浅灰链霉菌株对香蕉枯萎病菌有明显的拮抗作用;殷晓敏等从生长正常的香蕉假茎内分离获得1株枯草芽孢杆菌,能明显抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长,培养液滤液对孢子萌发具有良好抑制效果。可见分离筛选拮抗内生菌株防治该病害切实可行。但香蕉枯萎病拮抗内生菌的分离筛选研究主要集中于从香蕉植株中获得,另外关于内生菌防治香蕉枯萎病的盆栽试验报道较少。 海南省自然资源丰富,热带植物种类繁多,变叶木、益智、阴香、槟榔、椰子和菠萝蜜6种常见热带植物,取材方便。这些植物在热带地区经过长期演化,形成自身独特的微生物区系,在热带地区具有广泛的适应性。 为获得对香蕉枯萎病具有高拮抗活性的内生菌,本文从变叶木、益智、阴香、槟榔、椰子和菠萝蜜6种植物中分离、筛选内生拮抗菌株,并对拮抗效果理想的菌株进行盆栽防效试验,以期获得具有潜在应用价值的生防菌,为丰富香蕉枯萎病生防资源库奠定基础。 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 南药实行来源 益智(Alpinia oxyphylla Miq.)、阴香(Cinnamomum burmannii)、槟榔(Areca catechu):采集于海南热带植物园南药圃;椰子(Cocos nucifera L)、变叶木(Codiaeum variegatum)、菠萝(Artocarpus heterophyllus):采集于海南大学儋州校区。 香蕉(MusaABB)组培苗,由海南大学环境与植物保护学院提供。 1.1.2 ysporumsp.c设计标准 香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种。马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基。 1.2 实验方法 1.2.1 组织消毒和内生放线菌分离 将采集的新鲜健康供试植株根、茎、叶用自来水冲洗干净,室内晾干后,用75%酒精浸泡3～8min(根、茎8min,叶3min),无菌水冲洗3～4次,再用0.1%升汞浸泡2～3min,无菌水冲洗5次。无菌条件下将上述处理的各组织在培养基上作印迹,同时将表面消毒最后一次的无菌水涂抹于供试培养基上,做对照处理,检测植物表面消毒是否彻底。采用组织块法进行内生真菌分离,研磨法进行内生放线菌及细菌分离。分离平板适温培养2～7d。 1.2.2 内生菌的纯化 在空白对照组没有任何菌株生长的情况下,对分离出的内生菌进行纯化。内生真菌采用菌丝顶端逐步纯化法进行纯化,内生放线菌、细菌采用多次划线法进行纯化,纯化得到的菌株斜面保存,备用。 1.2.3 抗菌活性筛选 将香蕉枯萎病病原菌及分离出的内生菌扩大培养,备用。 采用对峙培养法对分得的内生真菌进行拮抗活性筛选:利用5mm的打孔器打取纯化好的内生真菌菌饼,接种于PDA平板中央,两边2cm处对峙接种同样大小的靶标菌菌饼,以中间不接内生菌为对照,每个处理重复3次,在25℃的培养箱中培养3d,用十字交叉法测量菌落生长直径,按下面公式统计抑菌率: 菌落直径(mm)=测量菌落直径平均值-5.0 采用对峙划线法对分得的内生放线菌、细菌进行拮抗活性筛选:用直径为5mm的打孔器打取靶标菌菌饼,接种于PDA培养基中央,在距离菌饼2cm处划线接种内生细菌。以不接内生放线菌、细菌为对照,每个处理3次重复,在25℃的培养箱中培养1～3d,测量抑菌带大小。 1.2.4 内生菌培养和病料处理 按要求配置菌株发酵液及查氏培养液,分别接入内生菌及靶标菌,适温180 r/min振荡培养3～5d,备用。 从海南大学儋州校区周边非香蕉种植地采集土壤,过20目筛,160℃灭菌2h,备用。取四叶期的香蕉组培苗,用清水将其根部冲洗干净,定植于已灭菌的土壤中,在28℃、20001x光照、12h光照/12h黑暗的下培养。10d后灌根法接入50mL浓度为109cfu/mL内生菌培养液,以无菌水为对照,每处理20次重复,在28℃、20001x光照、12h光照/12h黑暗的下培养。施加内生菌4d后,以伤根法接入20mL浓度为107cfu/mL靶标