炮制工艺和炮制时间对何首乌中二苯乙烯苷、鞣质含量的影响.docxVIP

炮制工艺和炮制时间对何首乌中二苯乙烯苷、鞣质含量的影响 何首乌是蓼科植物的多年生干燥部位。其炮制方法起源于唐代。历代本草中记载其炮制方法有所不同,主要体现在原药材的净制方法、加热方式、辅料的种类等。《中国药典》和《全国中药炮制规范》中,何首乌的炮制方法为黑豆汁蒸、黑豆汁炖和清蒸。经对全国20个省市的炮制规范总结,另有黑豆汁高压蒸、黑豆同煮、黑豆汁黄酒蒸等。炮制时间相差很大,从3 h至40 h不等。何首乌具有解毒、消痈、润肠通便之功效。经炮制后为制何首乌,具有补肝肾,益精血,乌须发等功效。何首乌所含二苯乙烯类成分具有保肝作用,在何首乌中的含量较高。结合蒽醌具泻下作用,何首乌炮制后药性改变的部分原因即为结合蒽醌转变为无泻下作用的游离蒽醌。炮制后毒性的降低可能为鞣质含量的变化。尽管对炮制前后何首乌中成分的含量变化有一些报道,但对不同工艺以及炮制时间的影响缺乏系统的研究,且某些报道的结论相反。目前对炮制工艺缺乏规范统一的工艺技术参数。因此,系统研究不同炮制工艺以及炮制时间对何首乌中成分含量的影响,对于确定最佳炮制工艺以保证何首乌饮片的质量具有重要意义。 1 药品、成分配产品 超声波清洗器(上海超声波仪器厂);HP1100高效液相色谱仪 G1322A脱气机、G1311A四元泵、G1316A恒温箱、G1314A VWD检测器、HP化学工作站;实验室试验用何首乌药材产自广东省德庆县德城镇,经中国中医研究院中药研究所谢宗万研究员鉴定为蓼科植物何首乌P.multiflorum的干燥块根,实验样品为自制生饮片和经黑豆汁蒸、黑豆汁炖、清蒸、黑豆汁高压蒸、黑豆汁屉上蒸(传统炮制方法)的饮片。中试药材来自广东、贵州、掌南和四川,生片和制片为在饮片厂生产饮片。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷,批号0844-200003,供含量测定用)、大黄素(批号0756-200110,供含量测定用)、大黄素甲醚(批号758-20000S,供鉴别用),由中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯,皮粉为分析纯,水为超纯水。 2 二苯乙烯酚的含量 2.1 色谱柱和检测波长 (3.9 mm×150 mm,5 μm)色谱柱,流动相乙腈-水(13∶87);流速1.0 mL·min-1;检测波长322 nm;柱温40 ℃。 2.2 标准曲线的绘制 取二苯乙烯苷对照品,精密称定,于棕色量瓶中,用甲醇配制成每1 mL 含0.03 mg的对照品溶液。分别吸取1, 3, 5, 7, 9 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,以测得的峰面积积分值为纵坐标,进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程,Y=-8.56+3 004.7X,r=0.999 9。表明二苯乙烯苷在0.03~0.27 μg具有良好的线性关系。 2.3 标准曲线见图1 按药典法进行。取各何首乌饮片粗粉(过4号筛)0.1 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入50%乙醇25 mL,称定重量。加热回流30 min,放冷,再称重,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,适当稀释,上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液得供试品溶液。 2.4 精密度测试 精密吸取同一供试品溶液重复进样5次,二苯乙烯苷峰面积积分值的RSD为1.2%。 2.5 重复试验 精密称取同一样品5份,按供试品溶液处理,进行含量测定,测得的二苯乙烯苷含量的RSD为1.8%。 2.6 返回率测试 精密称取同一样品5份,分别精密加入二苯乙烯苷对照品,按供试品溶液处理,进行含量测定,计算回收率为99.6%,RSD为2.5%。 2.7 苯乙烯苷的测定 精密吸取供试品溶液10 μL注入液相色谱仪,测定峰面积,计算样品中二苯乙烯苷含量。HPLC图谱见图1。不同炮制方法炮制12 h及32 h后,二苯乙烯苷含量测定结果见表1。采用豆汁炖不同时间,饮片中二苯乙烯苷的含量测定结果见表2。10个批次何首乌饮片采用黑豆汁炖32 h后,饮片中二苯乙烯苷的含量测定结果见表3。 3 c含量测定 3.1 铬ct183.9mm150mm，5m；流动相甲醇-0.1%磷酸7723； 流速1.0 mL·min-1;检测波长254 nm;柱温40 ℃。 3.2 标准曲线的绘制 精密称取大黄素、大黄素甲醚对照品各2 mg,分别置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀;分别精密量取大黄素溶液2 mL和大黄素甲醚溶液0.8 mL于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL含大黄素、大黄素甲醚40,16 μg的溶液,即得。分别吸取3, 5, 7, 9,11 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,以测得的峰面积积分值为纵坐标,进样量为横坐标(μg)绘制标准曲线,计算回归方程,大黄素:Y=1.78+3 244.20X,r=0