变性蛋白的复性课件.pptxVIP

变性蛋白的复性包含体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白等，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。优点：包含体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小。一、包含体形成的原因表达产率过高。 重组蛋白的氨基酸组成：含硫氨基酸。重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白 。蛋白质本身固有的溶解度。蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致包含体的形成。 二、包含体的分离和溶解包含体的分离：重组菌破碎－离心沉淀－低浓度的变性剂，去垢剂洗涤。包含体的溶解：强变性剂，强去垢剂。盐酸胍，脲，TritonX-100 ，SDS，巯基乙醇，EDTA等。三、包含体蛋白复性的方法理想复性的特点：活性蛋白质的回收率高正确复性的产物易于与错误折叠蛋白分离折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性方法易于放大复性过程耗时少1.稀释、透析复性法降低重组蛋白的浓度，减少聚集降低变性剂，去垢剂的浓度2.含二硫键的蛋白的复性空气氧化法加入氧化还原剂复性前，加入氧化型谷胱甘肽，可使其与还原型形成二硫键。用还原试剂加入二硫苏糖醇空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法. 封闭蛋白的疏水簇促进复性凝胶过滤层析复性小分子添加剂促进的复性分子伴侣或折叠酶促进的复性人工分子伴侣促进的复性第十二节 基因工程药物的质量控制 是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构，还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。 宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。《药品生产质量管理规范》（GMP） FDA/SFDA 国家药监局一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点产品安全性评价产品本身的结构严格控制条件二、 生物材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。 根据质量控制要求应了解以下 特性： ⒈明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证； ⒉应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物； ⒊ 应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性； ⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性； ⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。三、培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表达稳定； 始终能排除外源微生物污染。四、纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。五、目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。1.生物活性测定 需通过动物体内试验和通过细胞培养 进行体外效价测定。2.理化性质的测定 电泳方法: SDS、等电聚焦、免疫电泳 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA) 受体结合试验 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分 析、圆二色谱、核磁共振非特异性鉴别特异性鉴别相对分子质量测定等电点测定肽图分析氨基酸组成分析部分氨基酸序列分析蛋白质二硫键分析3. 蛋白质含量及纯度的分析 染色剂法、SDS、等电聚焦、各种HPLC、 毛细管电泳4.杂质检测①蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法②非蛋白类杂质 病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及DNA。常用检测方法：杂质和污染物 检 测 方 法内毒素 鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS、CE其它蛋白杂质 免疫分析、SDS、 HPLC、CE残余DNADNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异 肽谱、HPLC、 I