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骨性关节炎兔骨内固定治疗过程中关节软骨的动态改变 骨关节炎（oa）是一种常见的关节疾病，严重危害老年人的健康。随着年龄的增长，发病率呈显著上升，但其发病机制尚不清楚。建立骨关节动物模型对病因、病理和治疗的研究是非常重要的。 目前,已有许多关于骨性关节炎动物实验模型的研究,但大部分仅针对骨关节炎形成后骨关节某一方面的改变进行探讨,如光镜下软骨组织形态学改变、关节液中细胞因子如白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和/或肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)含量变化等。很少有研究涉及关节软骨组织形态学和细胞因子(IL-1β和TNF-α)的连续动态变化,有关采用电镜对骨关节炎发生过程中软骨形态变化的研究更少。本研究通过切断兔膝关节内侧副韧带和内侧半月板制备骨性关节炎动物模型,分别采用光镜和扫描电镜连续动态观察其关节软骨组织学变化,并在骨性关节炎发生过程中的不同时间点检测关节液中IL-1β和TNF-α含量的变化,旨在对骨关节炎模型的发生发展作一相对全面的研究,深入探讨骨性关节炎发生发展的过程和发病机制。 1 材料和方法 1.1 试验组和手术方法 15只成年新西兰大白兔(30个膝关节),体重为2.5kg~3kg,由北京大学医学部动物部提供。动物随机分为实验组(12只,24个膝关节)和对照组(3只,6个膝关节)两组。实验组均在两侧关节施行手术。经耳缘静脉注射20%乌拉坦(5ml/kg)全身麻醉,无菌条件下行膝内侧髌骨旁切口,仔细解剖内侧副韧带,切断并切除内侧副韧带长约0.5cm;打开关节腔,切除内侧半月板,缝合关节腔及皮肤。术后每只兔肌注40万单位青霉素,连续3天,以防膝关节感染。3只正常兔作为对照组。 1.2 对照组治疗方法 实验组动物分别于术后1周、2周、3周、4周取材,实验组每次取材3只(6个膝关节),对照组在第4周取材3只(6个膝关节)。麻醉后从髌上囊部位注射入关节腔1ml无菌PBS,反复活动关节后,仔细抽取灌洗液,做好标记后立即置于-70℃冰箱中保存备用,然后采用空气栓塞处死动物,切开关节腔,将游离的关节和关节囊固定于中性多聚甲醛固定液中。 1.3 观察指标 1.3.1 软骨表面的石墨分类 标本于10%多聚甲醛中固定3天后,流水冲洗12小时。内外股骨髁软骨面用蒸馏水洗净后,用滤纸轻轻擦干,用毛笔将墨汁刷于软骨表面,半分钟后,用蒸馏水将墨汁冲去,将上述过程再重复一遍。根据Yoshioka等的分类标准将软骨表面的大体所见分为4级:Ⅰ级:软骨面完整,无墨汁沉积;Ⅱ级:软骨表面轻度纤维化,墨汁染色可见长条形的斑点样沉积或淡灰色斑痕;Ⅲ级:软骨表面明显纤维化,墨汁染色可见深黑色斑痕,呈天鹅绒状;Ⅳ级:软骨表面糜烂,墨汁染色见软骨缺失,暴露软骨下骨。 1.3.2 木本糖组hematoxyin在精神质量和甲苯胺蓝染色 关节软骨经过固定后,常规脱钙、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片,苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)和甲苯胺蓝染色。 1.3.3 扫描电镜观察 标本取材后,经戊二醛固定,蔗糖冲洗及锇酸处理后,进行临界点干燥,喷金镀膜,完成电镜标本制作,在扫描电镜(日本电子公司,型号JSM-5600LV)下观察标本。 1.3.4 elisa试验 采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法。分别取每份关节腔灌洗液100μl进行IL-1β和TNF-α蛋白表达分析。应用美国Biosource公司提供的ELISA试剂盒,根据说明书具体操作。 1.4 染色结果的统计学处理 所有数据均用SPSS 11.5进行统计分析。关节软骨墨汁染色结果用Kruskal-Wallis秩和检验,ELISA结果用t检验,P0.05为有统计学意义。 2 结果 2.1 各级别单位的检测结果 表1显示,对照组股骨内髁Ⅰ级5例,Ⅱ级1例。实验组1周股骨内髁Ⅱ级4例,Ⅲ级2例;2周Ⅱ级1例,Ⅲ级4例,Ⅳ级1例;3周Ⅲ级4例,Ⅳ级2例;4周Ⅲ级3例,Ⅳ级3例。采用Kruskal-Wallis秩和方法检验各实验组与对照组之间均有显著性差异(P0.05)。 2.2 软骨组织结构失稳 对照组:HE染色示正常软骨基质呈淡粉色,着色均匀,软骨细胞核呈蓝色。软骨细胞排列有序,从上至下依次为表层、中间层、柱状层和软骨下骨层(图1A);甲苯胺蓝染色均匀,无基质失染(图1B);扫描电镜示软骨表面呈垄沟样排列,排列有序,软骨表面无血管及细胞分布,胶原纤维不裸露(图1C)。 实验组1周:HE染色示细胞排列开始出现紊乱,软骨内细胞密度不均一,有细胞簇聚现象(图1D);甲苯胺蓝染色部分失染(图1E);扫描电镜示关节软骨表面垄沟样结构可见,垄部低平,沟部变浅,无软骨细