3D打印PBS-CS房间隔缺损补片材料表征和细胞学测试.docxVIP

? ? 3D打印PBS/CS房间隔缺损补片材料表征和细胞学测试 ? ? 夏颖慧,邱水玮,孙江东,邢泉生 (1 青岛大学附属妇女儿童医院心脏中心,山东 青岛 266034； 2 青岛大学医学部神经再生与康复研究院) 房间隔缺损(ASD)是常见的先天性心脏病之一，占先天性心脏病的13%～18%[1]。ASD通常的治疗方法是使用镍钛合金封堵器经导管封堵，该法的好处是创伤小、住院时间短，但从长远来看，镍钛合金封堵器不可降解，且有增加心律失常、血栓等并发症的风险[2-3]。因此，开发生物可降解材料制作心脏缺损封堵装置是当前需要解决的问题。聚丁二酸丁二醇酯(PBS)是脂肪族聚酯类材料，具有高结晶度，制成补片可以提供较好的硬度，从而起到支撑作用。同时，PBS还具有良好的可加工性，可以通过挤出、注射成型等方法进行加工[4-5]。但由于该材料降解时间较长，且其高疏水性不适合细胞附着，目前较少应用于医学领域[6]。有研究发现，当PBS与壳聚糖(CS)复合时，不仅不影响各材料的性能，还可在一定程度上起到互相促进的作用[7]。CS作为一种天然来源的半合成氨基聚糖，具有良好的生物相容性、可降解性以及生物黏附性[8-10]。CS通过与聚酯类材料复合改性，可应用于组织再生和细胞支架等领域[11-12]。同时，3D打印CS水凝胶目前在医学领域(如组织工程、纳米载药、伤口敷料等)也得到广泛的研究[13-16]。为了探究PBS/CS用于3D打印加工的可行性以及该复合材料作为医疗植入物的理化性能，本研究对PBS/CS进行材料表征和细胞学测试，为开发新型可用于3D打印制作心脏补片的可降解材料提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 主要材料 PBS(注塑级，上海麦克林生化科技有限公司)；CS(脱乙酰度≥95%，黏度100～200 mPa·s，上海麦克林生化科技有限公司)；NIH/3T3细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司)；DMEM高糖培养液(北京索莱宝科技有限公司)；活性氧(ROS)检测试剂盒(Beyotime，S0033S)；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(Beyotime，C1062S)；Phalloidin-iFluor 555抗体(ab176756，Abcam，美国)。 1.2 复合材料的制备及表征分析 1.2.1PBS/CS材料的制备 将PBS真空干燥4 h(温度50 ℃，真空度-0.1 MPa)。按投料质量比9∶1、8∶2称取PBS和CS，分别命名为PCS1和PCS2，依次倒入转矩流变仪密炼模块，设置密炼模块的前、中、后温度均为160 ℃，转速30 r/min，密炼共混10 min。室温冷却后封装入预先干燥除水处理的密封罐中。 1.2.2扫描电镜观察表面形貌 为了观察添加CS对PBS结构的影响，通过模具注塑将PBS/CS、PBS制作成哑铃状拉伸测试样条，液氮冷脆1 h后脆断截取其断面。将断面真空干燥后用导电胶固定在样品台上，断面喷金处理，使用日本日立公司生产的Regulus 8100型场发射扫描电子显微镜对断面进行观察，获取图片。 1.2.3傅立叶变换红外光谱测试结构表征 PBS、PCS1、PCS2和CS样品使用美国赛默飞公司生产的Nicolet iN10MX型傅立叶变换红外光谱仪进行分析。分辨率为4 cm-1，扫描次数32次，扫描范围4 000～400 cm-1。 1.3 3D打印ASD补片的制备 使用熔融挤出式3D打印机进行PBS/CS心脏补片的制作。将20 g真空干燥后的PCS1和PCS2颗粒料倒入3D打印机挤出筒内，加热至175 ℃，待材料呈熔融状态后以7.5 mm/s匀速挤出。打印参数：喷头直径0.35 mm，打印厚度5 mm，打印层数2，网孔间隔5 mm。 1.4 细胞学测试 1.4.1细胞培养与材料浸提液的准备 NIH/3T3细胞在37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下，使用含体积分数0.10小牛血清和体积分数0.01青霉素/链霉素的DMEM高糖培养液进行培养。当细胞密度在每个培养皿达80%～90%时，应用2.5 g/L的胰蛋白酶在37 ℃条件下消化细胞，直至细胞从培养皿中脱落，将细胞收集进离心管中，以1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入磷酸盐缓冲液以1 200 r/min离心5 min，弃上清后用DMEM培养液重悬细胞，并按每培养皿(直径10 cm)1×105个细胞的密度定殖新培养皿，放入培养箱培养，选择密度为60%～70%的细胞进行后续实验。 根据国家医疗器械生物学评价标准(GB/T 16886.5-2017)制备材料浸提液，以检测材料浸提液对细胞影响。3D打印补片进行环氧乙烷灭菌后，按照每平方厘米材料加入1 mL培养液的比例，无菌环境下在10 cm培养皿中加入含体积分数0.10小牛血清的DM