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e-oh调控系统和crelolex基因剔除系统双重调控hcvns3aa丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠的建立 目前，世界上近3%的人口感染了丙类肝炎病毒（hcv）并进展缓慢。慢性丙肝炎（chc）是肝损伤、肝硬化和肝癌的主要原因。HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在病毒编码蛋白前体的加工、成熟过程中起重要作用,因此与病毒复制密切相关。不仅如此,NS3/4A蛋白酶还与宿主细胞内一系列固有免疫相关蛋白相互作用,从而改变或阻断重要的抗病毒固有免疫通路,在HCV逃避固有免疫的过程中发挥至关重要的作用。因此,针对NS3/4A蛋白酶的特异抑制剂不仅能有效阻断病毒的复制,而且有助于感染者体内固有免疫反应的重新恢复。然而,由于HCV的宿主狭窄性,至今都未能建立合适的HCV感染小动物模型,这不仅阻碍了针对NS3/4A蛋白酶作用机理的深入研究,也使特异性抑制剂筛选、评价都仅仅停留在细胞水平。目前,普遍认为较适合作为小动物感染模型的人肝脏嵌合的免疫缺陷小鼠显然不适于研究NS3/4A蛋白酶与宿主免疫系统的相互作用,而传统的转基因小鼠模型也因免疫系统对靶蛋白的终身免疫耐受而无法进行类似研究。我们在前期研究的基础上,通过联合应用Tet-on四环素调控系统和Cre/loxP基因剔除系统,建立了严格可调控型表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,以期能同时弥补以上两类模型的不足,为NS3/4A蛋白酶在体内的作用机制和抑制剂的筛选、评价奠定基础。 1 材料和方法 1.1 cre重组酶及ss3/4g-b治疗 Lap/LC-1双转基因小鼠、Lap/NS3/4A双转基因小鼠分别已由本室建立,2种双转基因小鼠各自含有完整的Tet-on调控系统。如图1所示,Lap/LC-1双转基因小鼠基因组携带Lap和LC-1转基因片段,LAP转基因片段在肝脏组织组成型转录、翻译产生的反向四环素调控转录激活因子(rtTA),但只有与外源性多西环素(doxycycline,Dox)结合形成的复合物与Tet-on双向启动子结合后,才可启动LC-1转基因片段的转录,进而翻译产生Cre重组酶及萤光素酶。Lap/NS3/4A双转基因小鼠基因组携带Lap和NS3/4A转基因片段,其Lap转基因片段在肝组织中组成型表达的rtTA也只有与Dox结合形成复合物后才能与NS3/4A转基因片段内的Tet-on启动子结合而启动转录,并终止于NS3/4A基因上游的BGH polyA处,因而只翻译产生萤光素酶而不产生NS3/4A蛋白酶。 PCR试剂(包括rTaq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP、DL2000 DNA marker、DNA电泳10×上样缓冲液等)为TaKaRa公司产品;多西环素为Sigma公司产品;萤光素(D-luciferin)为Caliper Life Sciences公司产品;Cre重组酶兔源一抗为Merck公司产品;NS5B蛋白鼠源一抗由本室制备。 PCR扩增仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳成像系统均为Bio-Rad公司产品;在体生物发光成像(in vivo bioluminescent imaging,BLI)采用Caliper Life Sciences公司的Xenogen IVIS Kinetic系统。 1.2 引用材料的设计与合成 根据引物设计原则,以基因组DNA为模板扩增转基因片段(部分)的引物序列见表1,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 1.3 基因组dna的提取和鉴定 选取6~8周龄、已分别经PCR和BLI鉴定为强阳性的双转基因小鼠Lap/LC-1与Lap/NS3/4A双转基因小鼠交配,子代鼠3~4周龄时剪趾编号并收集,常规方法提取基因组DNA,PCR法分别鉴定Lap、LC-1和NS3/4A转基因片段。Lap和LC-1片段的PCR扩增条件为94℃50 s、55℃30 s、72℃30 s,共30个循环;NS3/4A片段的PCR扩增条件为94℃50 s、55℃50 s、72℃2 min,共30个循环。初检完成后,再次从子代鼠剪尾收集、提取基因组DNA、PCR鉴定后完成复检。Lap、LC-1和NS3/4A转基因片段均阳性的三转基因基因小鼠予以保留。 1.4 小鼠材料白砂糖液 经PCR鉴定的三转基因小鼠随机分组并以Dox进行诱导:实验组以Dox饲喂,Dox溶液浓度为1 mg/mL,并含50 g/mL白砂糖;对照组只以50 g/mL白砂糖液饲喂。连续饲喂8 d后小鼠腹腔注射萤光素(萤光素酶底物),剂量以小鼠体重为参考标准(150mg/kg)。注射萤光素的小鼠在麻醉后置于BLI系统内,检测体内萤光素经萤光素酶催化反应后产生的发光信号,成像阳性的小鼠予以保留并做以下分析。 1.5 叶片的诱导表达 将上述成像阳性的小鼠处死,并分别取肝脏、肾脏、心脏等组织,迅速置于4%中性甲醛液中固定