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骨骼肌雄激素受体在运动训练中的变化 由于四肢固定，骨轻软膜萎缩是康复医学中常见的问题。如何迅速地缓解肌肉萎缩,恢复机体的运动能力,有着重要的理论和实践意义。骨骼肌废用性萎缩以肌肉蛋白合成代谢减弱,分解代谢增强为主要特征,而肌肉蛋白的同化作用与局部肌肉组织的雄激素受体(androgen receptor, AR)结合容量密切相关。以组织学、组织化学、生物化学及分子生物学等手段,观察细胞内的AR变化,尤其是在运动训练后的变化,有重要的价值。以往有学者对废用性肌萎缩及康复过程中肌纤维形态、组织氨基酸谱等分别进行了研究。但迄今为止,在肌肉萎缩及不同方式康复后骨骼肌AR结合容量的变化,尚不清楚。作者试图通过对该问题的研究,以探讨不同的康复方式对肌萎缩恢复的作用。 1 数据和方法 1.1 正常饲养期间的养殖情况 雄性SD大鼠30只,6月龄,由北京医科大学实验动物中心提供。随机分为5组,每组6只。 A组(正常对照组):正常饲养9周后宰杀。 B组(固定即杀组):正常饲养3周,外固定3周后立即宰杀。 C组(自然康复组):正常饲养3周,外固定3周,自然恢复3周后宰杀。 D组(跑台康复组):正常饲养3周,外固定3周,小强度跑台训练3周后宰杀。 E组(游泳康复组):正常饲养3周,外固定3周,小强度游泳训练3周后宰杀。 1.2 下行右下肢管型石膏 除A组外,所有大鼠均在2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉下行右后肢管型石膏固定,膝关节屈曲120°—135°,髋关节置于外翻位。固定期间,每日检查固定部位情况,因大鼠啃咬、挣扎,下肢水肿、淤血或肌萎缩造成的固定不适,随时给予重新固定。 1.3 党支部每周期学训练成绩 D、E两组解除固定后,给予5d的休息适应,(前3d休息,后2d每天适应性练习15min),然后分别进行跑台和游泳训练,以7d为一训练周期,每周期训练5次,每天1次。参照Bedford的研究,跑台组每次训练时间为60min,跑速及跑台坡度缓慢递增,第1周跑速为11m/min,坡度为0%;第2周为11m/min,坡度为5%;第3周跑速为15m/min,坡度5%。游泳组每次训练时间每周递增,第1周每次为30min,第2周为60min,第3周为90min。游泳时大鼠尾部不负重,游泳池水深0.75m,水温保持在32℃—36℃。 1.4 去势手术 在麻醉下剪开大鼠尾部皮肤及包膜,结扎双侧睾丸动脉后摘除双侧睾丸,缝合包膜及皮肤,48小时后宰杀。 1.5 肌纤维蛋白包及其他总糖质 将大鼠麻醉后,于冰浴下切开右后肢皮肤、皮下筋膜,暴露出股四头肌,钝性分离并完整取下股四头肌,将肌腱及肌筋膜除去,以预冷的生理盐水冲洗,沿肌纤维长轴纵行切为两段,一段以滤纸吸干,称重,锡纸包裹后入液氮保存,留待测AR。另一段分切成(2×2×4)mm大小与肌纤维纵轴一致的长条,立即放入10%中性福尔马林(pH 7.4)固定液中,留待作组织学切片。 1.6 抑制剂及缓冲液 [1,2,6,7-3H]-睾酮(美国杜邦公司),工作液浓度为150pmol/ml,反应体系的同位素终浓度为50pmol/ml;抑制管中的抑制剂睾铜为Sigma公司产品,工作液浓度为75nmol/ml,是同位素浓度的500倍。缓冲液为0.01M T.E.D 缓冲液(0.01M tris-HCl,0.0015M EDTA,0.5mM DTT,pH=7.4);3% DCC液(0.3% Dextron, 3% Coat-coal)。 1.7 a组合容量的测定 1.7.1 机械匀浆器polustron,pt10.d缓冲液 将存入液氮的肌组织缓慢升温至0—4℃,以下操作过程环境温度严格维持在0℃—4℃。将肌组织剪碎,按照1∶4(W/V)的稀释度加入0.01M T.E.D 缓冲液,以内切式机械匀浆器(Polytron,PT10/35, KINEMATICA,瑞士)匀浆。匀浆条件为6—8级转速,每次5s,间隔25s,共3次。将匀浆组织用超速低温离心机(KONTRON 瑞士)离心,转头为TST41.14,转速为27000r/min(108000×g),温度为4℃,离心时间为1h,上清即为所需胞浆。 1.7.2 胞浆蛋白的测定 采用葡聚糖包裹活性炭吸附法进行受体结合容量的单点法测定。以1.5ml的Appendorf管为反应管,设定3个平行管,反应系统如表1。反应体系在4℃下孵育18~24h,加入预冷的3%DCC液500μl,充分振荡,吸咐5min,6000r/min×5s,离心3次,提取上清液400μl,加入甲苯闪烁液孵育过夜,以β-液闪仪(LKB1209)计数。 胞浆蛋白测定采用Folin-酚定蛋白法。 AR结合容量(fmol/mg)=样品cpm/标记物比放射性(Ci/mmol)×2.22×109×受体蛋白浓度(mg)×计数效率。 1.