第五讲基因芯片检测技术演示文稿.pptVIP

灵敏度范围很重要 虽然通常扫描仪的灰度值在0-65535之间，有很大的动态范围，但调节仪器的灵敏度范围对于基因芯片来讲仍是很重要的 。 第一，在不同的样本之间，由于样本RNA的质量、标记效率和杂交效率等原因，使不同样本之间的荧光强度变化很大；第二，在同一样本内部，不同的基因表达丰度相差极大，高丰度的mRNA可以占mRNA中1％的丰度，而一些微量表达的基因只占mRNA中百万分之一以下的丰度。 如果扫描仪的灵敏度范围设置不当，会出现两种情况：第一：扫描强度太弱，总体信号太弱，弱信号点（无效点）比例太高，对于大量的低丰度表达基因无法测出；第二：扫描强度太大，总体信号太强，导致大量的点信号达到饱和，饱和点的信号会导致两种荧光信号比值压缩，无法分析差异表达基因，另外，大强度扫描还会导致高背景及激光管迅速老化。 当前第29页\共有74页\编于星期五\9点 调整仪器灵敏度范围的方法 其一是改变激发光的强度，如用激光衰减器可调整改变激发光的强度其可调范围至少为100：1 其二是改变光探测器的灵敏度，如果PMT扫描仪，则改变光电倍增管的灵敏度，通过变化输入电压的大小，光电倍增管的灵敏度改变范围至少为100：1 对于CCD检测系统，改变镜头的数字光圈可以提高采光效率，从而改变检测灵敏度。 当前第30页\共有74页\编于星期五\9点 像素与分辨率 像素是构成图像的最小单元，即图像上不同颜色或灰度的点，这些点组合起来形成一幅完整的图像。在CCD上为CCD的最小感光单元，其大小通常在几个微米到十几个微米，通过成像公式可换算成检测芯片上对应区域的大小。对于激光系统，像素的大小为激光光斑的尺寸，可以通过改变光斑直径来改变像素的大小。 分辨率是指能够区分的最近两个点的最小距离 。 像素的大小决定了分辨率的高低，像素越大，分辨率越高，分辨率越高则图像越清晰，定量的准确度就越高，可以提供更精细的具有统计意义的数据。 当前第31页\共有74页\编于星期五\9点 像素与分辨率 激光系统扫描仪的分辨率主要是由激光的聚焦直径决定的，分辨率一般为5～10μｍ。CCD系统扫描仪的分辨率主要决定于CCD像素的数目，一次成像型CCD扫描仪的分辨率一般为大于或等于20μm，多次扫描拼接成像型则可达2.5μm。 当前第32页\共有74页\编于星期五\9点 扫描仪 控制和自动化系统是由电脑来完成的 。 图形化的操作界面使得初学者只需接受简单的训练或阅读操作手册就能够使用仪器，因此扫描仪使用者并不需要精通扫描仪的光学和电子学部分 控制软件具有许多自动设置功能，如不同的用户扫描不同样品可设置、保存、再现扫描参数；可自动设定2个以上的扫描激光波长并自动保存图像结果；对某一扫描波段自动调整灵敏度、激发光强度、及探测器探测范围等。 当前第33页\共有74页\编于星期五\9点 当前第34页\共有74页\编于星期五\9点 商品化生物芯片扫描仪 激光共聚焦扫描仪 — ScanArray系列、SureScan芯片扫描仪、DNAscope? 系列。 激光非共聚焦扫描仪 — GenePix 系列 CCD基因芯片检测仪 — AlphaArrayTM 基因芯片扫描分析系统、GeneTAC扫描仪、SpotWare 基因芯片扫描仪 、ArrayWoRx“e”扫描仪 国产扫描仪 —成都中科百奥科技有限公司 SCAN-1、北京博奥生物芯片有限责任公司EcoSCANTM-100? 当前第35页\共有74页\编于星期五\9点 扫描过程应注意的问题 由于芯片扫描仪有极高的灵敏度和分辨率，芯片上很小的尘埃或杂质污染都会引起非常明亮的背景和噪音，因此在芯片的制作，杂交和清洗过程中都应在洁净的环境中进行，最好在洁净台或者洁净间操作，并注意防静电。 芯片完成杂交和清洗后应尽可能立即扫描测定，防止荧光标记靶分子降解。杂交后的芯片应避免长期暴露在强光下，因而导致光漂白，影响测定结果。 芯片扫描中由于有机械传动装置，因此仪器应放置在平稳坚固的平台上，并注意防止外源性震动。 当前第36页\共有74页\编于星期五\9点 芯片图像处理 当前第37页\共有74页\编于星期五\9点 灰度图 最原始的图谱是黑白的，显现的是灰度值，一般扫描仪所得到的图谱为16位的Tif、Jpeg、Raw等格式的图像（也有些扫描仪能得到更高的24位的图像），每个像素的灰度值在0-65535之间的范围内，每个灰度值都反应了图像所对应芯片位置的荧光分子相对强度信息。 当前第38页\共有74页\编于星期五\9点 伪彩图 在扫描仪配套的扫描软件中一般都内建有能将原始的灰度图改为伪彩图的功能。由于肉眼对区分同种颜色的不同强度（灰度）并不敏感，因此就人为的将灰度值根据其数值大小转化成不同颜色，以便