毛细管电泳-激光诱导荧光光谱法检测谷胱甘肽.docx

毛细管电泳-激光诱导荧光光谱法检测谷胱甘肽 谷胱甘醇（gsh）是一种由谷氨酸（gsh）、半胱氨酸（cysy）和甘氨酸（gly）通过氨基酸化合物关系生产的具有生物活性的二羟化合物（图1）。自然界中谷胱甘肽以还原型(GSH)和氧化型(Glutathione Oxidized,GSSG)2种状态存在,通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽。人工已研制开发出的谷胱甘肽药物,广泛应用于临床,除利用其巯基解毒外,还用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等,作为辅助治疗的药物。 目前关于谷胱甘肽的检测方法较多,如高效液相色谱法,荧光法,与各种检测器结合的毛细管电泳法和其他电化学检测法等。同时检测谷胱甘肽及其构成氨基酸的方法较少,仅见于使用高效液相色谱法来同时检测这五种物质。 本实验建立了一种分离测定还原型和氧化型谷胱甘肽及其构成氨基酸的毛细管电泳-直接LIF法。五种物质经NBD-Cl衍生后,在含有Brij-35和乙腈的硼砂缓冲体系中得到了较好的分离。该方法被应用于注射用谷胱甘肽钠粉针样品的分析,得到了比较理想的效果,有望应用于谷胱甘肽药物制剂的质量监控以及为谷胱甘肽及其药物代谢研究奠定了一定的基础。 1 实验部分 1.1 仪器、试药与仪器 贝克曼P/ACETMMDQ型毛细管电泳系统(Beckman Coulter Instrument,Fullerton,CA,USA):配有使用氩离子激光光源的激光诱导荧光检测器(λex/λem=488/520 nm),系统由安装32 Karat软件(8.0版)的联想电脑控制。 未涂层熔融石英毛细管(总长度50.2 cm,有效长度40 cm,内径为75 μm,河北永年锐沣色谱器件有限公司);KQ-250DE型数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);pHS-3C酸度计(成都世纪方舟科技有限公司);Millipore synergy UV超纯水系统(Milford,MA,USA);V0876X-5型混旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。 氧化型谷胱甘肽(纯度98%),聚氧乙烯月桂醚(Brij-35,AR),购自百灵威科技有限公司;还原型谷胱甘肽(纯度99%),L-谷氨酸(纯度98%),L-半胱氨酸(纯度98%),甘氨酸(纯度98%),购自阿拉丁公司;4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD-Cl,比利时Acros公司);硼砂(AR,Sigma);乙腈(AR,四川航嘉生物医药科技有限责任公司);注射用还原型谷胱甘肽钠冻干粉针剂(绿叶制药,购于成都市第一人民医院);HCl,NaOH(AR,成都市科龙化工试剂厂);实验用水为超纯水。 1.2 nbd-cl和乙腈溶液的配制 称取还原型和氧化型谷胱甘肽、L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸,加水溶解,配制成1 g/L标准储备液,实验中用超纯水稀释至所需浓度。将NBD-Cl溶于乙腈,配制成100 mmol/L储备液,实验中用乙腈稀释至所需浓度。所有储备液均在4℃冰箱储存备用。 1.3 谷胱甘肽钠的含量 样品鉴定:准确称量谷胱甘肽钠药品总重为0.6620 g,药瓶上标示药品的有效成分总重为0.06 g,则药品中谷胱甘肽钠的含量为90.6%。 样品配备:配制谷胱甘肽钠(纯品)含量为2000 μg/mL的样品溶液。放入冰箱中4 ℃冷藏保存。实验中用超纯水将其稀释至所需的浓度。 1.4 nbd-cl的制备 依次向1 mL的微型离心管中加入50 μL样品标准溶液(或样品溶液)、100μL衍生缓冲溶液和100 μL NBD-Cl溶液,充分混合后,将上述溶液置于50 ℃水浴中反应20 min,待反应混合物冷却至室温后,用超纯水稀释至0.5 mL。混合均匀后直接进样分析。对于空白溶液的制备,需向离心管中加入超纯水50 μL,其余操作步骤和对标准溶液(或样品溶液)的衍生过程相同。 1.5 毛细管的冲洗 运行缓冲溶液:15 mmol/L硼砂,20 mmol/L Brij-35,10%乙腈(体积比),pH 9.75。新毛细管使用前分别用甲醇冲洗5 min,1.0 mol/L HCl、1.0 mol/L NaOH和超纯水各冲洗10 min;每天实验前毛细管用1.0 mol/L HCl、0.5 mol/L NaOH、超纯水和分离缓冲溶液各冲洗5 min;两次运行之间,毛细管依次用0.5 mol/L NaOH冲洗1 min,去离子水冲洗2 min,分离缓冲溶液冲洗3 min。分离电压17.5 kV,分离柱温25 °C,0.5psi(3447.5 Pa)压力进样3 s。 2 结果与讨论 2.1 对于分离条件的优化 2.1.1 缓冲液ph值的影响 缓冲液pH值一方面通过改变毛细管内壁电荷极性及密度来影响电渗流,另一方面通过改变分析物的带电性质来影响待测物质的迁移行为。本实验在pH