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酵母双杂交技术在病毒蛋白-蛋白相互作用研究中的应用 蛋白质-蛋白质相互作用在病毒的生命过程中起着非常重要的作用。病毒dna（rn）的复制、复制、rnd、去除、蛋白质翻译和分泌、信号传达和各种代谢过程与蛋白质相互作用有关。对病毒生命过程中蛋白质作用的研究有助于揭示其生命过程的许多本质问题, 但由于蛋白与其他生物大分子间的作用依赖于细胞内环境, 并且与作用时间和作用力密切相关, 而传统的生化方法很难满足生命过程所需的各种条件, 使得对蛋白间相互作用的研究进展缓慢。酵母双杂交技术的出现及发展极大地推动了这方面的研究, 成为分析鉴定病毒蛋白-蛋白相互作用及调控的强有力工具, 并显示出了广泛的应用前景。 1 酵母双杂交体系的构建 酵母双杂交技术又称“相互作用陷阱” (interaction trap) , 是Fields等于1989年建立的研究蛋白间相互作用的遗传学方法。该技术是在对真核生物调控转录起始过程认识的基础上建立起来的。研究表明, 许多真核细胞的基因转录起始需要反式转录激活因子的参与, 这些反式转录激活因子是由结构和功能相对独立的DNA结合结构域 (DNA-binding domain, BD) 和转录激活结构域 (transcriptional activation domain, AD) 组成的。不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的转录激活功能, 二者对特定基因的激活表达缺一不可。酵母双杂交体系的构建如下所述:将编码已知蛋白质 (常称为诱饵蛋白质, bait protein) 的基因与编码DNA结合结构域的序列融合, 在酵母中表达产生融合蛋白质BD-Bait;将编码未知蛋白 (常称为捕获蛋白质, prey protein) 的基因与编码转录激活结构域的序列融合, 并在酵母中表达产生另一融合蛋白AD-Prey。之后, 2种融合蛋白在酵母中共表达, 如果Bait和Prey能发生作用, 将引导BD和AD相互结合并产生具有功能的转录激活蛋白, 从而激活报告基因转录;如果Prey和Bait不能相互作用, 则BD和AD不能结合, 报告基因的转录就不能被激活。因此, 可通过检测报告基因是否被转录来研究蛋白质间的相互作用。如果将Prey换成基因文库, 即可直接从基因文库中筛选到能与Bait相互作用蛋白的DNA序列。 2 采用双杂交繁殖技术在病毒学研究中的应用 酵母双杂交技术是一个具有开创意义的研究方法, 已经广泛地运用在病毒分子生物学研究的各个领域。其最主要的用途有以下4个方面。 2.1 hbv在细胞内抑制tnf-功能 酵母双杂交技术在病毒学研究中最为重要的用途是, 从宿主细胞cDNA文库中筛选与病毒特异性蛋白质相互作用的未知蛋白。即将宿主细胞cDNA与AD序列相互融合, 已知病毒特异性蛋白基因与DNA-BD序列结合, 通过检测报告基因的转录情况, 寻找与已知病毒蛋白发生作用的未知宿主蛋白质。利用该方法已经证实了许多未知蛋白间的相互作用, 揭示了大量未知蛋白的功能及调控机制。腺病毒E3所编码的E3-14.7×103蛋白能抑制TNF-α的功能, Yongan等利用酵母双杂交技术从Hela细胞的cDNA文库中发现了一个特殊的宿主蛋白FIP-2, 它是E3-14.7×103在细胞内的靶蛋白, E3-14.7×103通过与FIP-2结合来实现对TNF-α的抑制功能, 从而揭示了腺病毒能够抑制肿瘤坏死因子功能的机理。乙肝病毒 (HBV) X基因的表达产物HBX是一个功能复杂的蛋白质, 它在病毒的感染、复制、转录等过程中均起重要作用。Melegari等也用双杂交技术从肝癌细胞cDNA文库中找到与HBV X蛋白 (HBX) 结合的宿主蛋白IXP, 并证实IXP能够通过与HBX的结合抑制病毒活性, 从而改变病毒的复制周期。这一发现为研究HBV感染机制及治疗提供了有用的信息。Mamiya等用类似方法, 以丙型肝炎病毒 (HCV) C蛋白为诱饵, 从人肝细胞cDNA文库中发现一种ATP依赖性RNA螺旋酶——DBX, 它能使细胞内帽依赖性RNA的翻译受到抑制而不影响病毒RNA的翻译。EB病毒的BHRF1蛋白具有抗细胞凋亡作用, 能够抵抗多种刺激引起的细胞凋亡。Li等从人包皮角化细胞cDNA库中筛选到一种可与BHRF1相互作用的蛋白——PRA1蛋白, 它能减弱BHRF1的抗细胞凋亡活性, 可能起着阻碍病毒成熟的作用。 2.2 hcvc蛋白与细胞间相互作用的研究 酵母双杂交技术创立之初就是为了用来研究已知蛋白质之间相互作用的。目前, 通过该系统已经确定了许多重要蛋白质之间的相互作用。在病毒学研究方面, 可用于病毒与宿主蛋白之间和病毒自身蛋白之间的相互作用研究, 以探讨病毒生物学过程的发生机制。 2.2.1确定病毒蛋白与宿主受体蛋白间的相互作用