6种注射用聚氧乙烯脱水山梨醇的体外溶血性研究.docxVIP

6种注射用聚氧乙烯脱水山梨醇的体外溶血性研究 聚氧乙烯脱硅醇单油酸酯（吐温80、特韦-80、洛比-80、硫醇酸酯、聚山梨酯80）是一种非离子表面活性剂，通常用作药物制备中的原料之一。在中药注射剂中,吐温80为常用增溶性辅料,用量较大。据报道,《部颁中药标准》收载的中药注射剂制剂工艺中注明添加吐温80者有34种,其中吐温80含量超过0.5%者就有18种。由于吐温80生产中原料植物油脂成分差异和生产工艺的复杂性,导致不同产地生产的注射用吐温80的物理化学性能和纯度均存在一定的差异,由此也给中药注射剂带来安全性隐患。本课题选择6种不同产地来源的注射用吐温80,利用豚鼠和家兔为受试动物,对其致敏性及溶血性进行了临床前实验性评价。 1 试剂与检测方法 Hartley白化豚鼠160只,雌雄兼用,体重280～320 g;日本大耳白兔1只,普通级,体重2～2.3 kg,雄性。由郑州康达实验动物中心提供,实验动物许可证号SCXK(豫)2005-0002。实验前适应饲养1周。 6种不同来源的注射用吐温80包括:吐温80(国内某公司生产,注射级,无色稠状液体,批设为“A”;吐温80(国内某公司生产,注射级,黄色稠状液体,批号080819)设为“B”;吐温80(国内某公司生产,注射级,无色稠状液体,批号090620)设为“C”;吐温80(国内某公司生产,注射级,浅黄色稠状液体,批号090727)设为“D”;吐温80(国外某公司生产,注射级,浅黄色稠状液体,批号00002857774)设为“E”;吐温80(国外某公司生产,注射级,无色稠状液体,批号005363A)设为“F”。牛血清白蛋白(Sigma公司),设为阳性对照“G”。0.9%氯化钠注射液(郑州永和制药有限公司,批,设为阴性对照“H”。临用前A,B,C,D,E,F均用NS配制成0.5%的浓度,G用NS配制成0.6%的浓度。甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。 本课题组前期从质控的角度,采用HPLC与ELSD联用,检测比较了各成分峰数目和主成分峰面积百分比。主成分峰的出峰位置和出峰时间基本一致(表1)。 TDL80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);UV2550紫外-可见分光光度计(日本岛津);Master-S超纯水机(上海和泰仪器有限公司)。 2 细胞培养和给药及结果 取豚鼠64只,按性别体重分层随机分为8组,每组8只,雌雄各半,对应本实验所设吐温80代号,命名为A组、B组、C组、D组、E组、F组,另设阳性对照(G)组和阴性对照(H)组。各组雌雄均分笼饲养。于试验的第1,3,5天,各组分别以每只豚鼠0.5 mL的给药量ip相应受试物:H组为NS,G组为牛血清白蛋白,每只3 mg,A,B,C,D,E,F组剂量均为每只2.5 μL吐温80。末次致敏后14 d进行激发,激发途径为足趾静脉注射,激发时各组动物给予致敏时相同受试物,激发剂量为致敏剂量的2倍,注射体积均为每只1 mL。致敏期间每天观察各豚鼠的状态,初次和末次致敏及激发当日称取各动物体重,观察有无异常改变。激发后立刻至30 min,按照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中的有关ASA试验的症状观察和全身过敏评价标准(表2),记录每只动物的过敏反应症状,分析过敏反应强度。 豚鼠16只,按性别分层随机分为8组,每组2只,雌雄各半;各组雌雄均分笼饲养。各组致敏剂量、致敏途径和频次均同ASA试验;于第3次致敏后14 d,将动物用戊巴比妥钠30 mg·kg-1腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,4 000 r·min-1离心15 min,分离血清并按组合并,置-20 ℃保存备用。被动皮肤致敏:豚鼠64只,雌雄各半,按性别体重分层随机分为8组,每组8只,各组雌雄均分笼饲养。各组致敏血清用NS分别按1∶2,1∶4,1∶8,1∶16稀释;预先将豚鼠脊柱两侧脱毛3 cm×4 cm,在两侧脱毛区域距脊柱约1.5 cm处各选取2个注射部位,两部位间隔2 cm,分别皮内注射1∶2,1∶4,1∶8,1∶16的稀释血清0.1 mL以被动致敏。豚鼠被动致敏24 h后,各组足趾静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等体积的0.6%伊文思兰染液每只1 mL进行激发,30 min后,麻醉处死各组动物。剪取背部给药部位皮肤,测量皮肤内层蓝斑大小并拍照。蓝斑直径5 mm者判定为阳性,并用稀释倍数表示,不规则蓝斑直径为[(长径+短径)/2]。 从兔心脏采血10 mL,放入盛有玻璃珠的三角瓶中振摇10 min,除去纤维蛋白原,使成脱纤血。加约10倍量的NS,摇匀,1 500 r·min-1离心15 min,除去上清。取沉淀的红细胞再用NS如上法洗涤2～3次,至上清不显红色为宜,将所得红细胞按其容积用NS稀释成2%的混悬液,备用