caco-2细胞模型的建立及药物吸收研究的初步应用.docxVIP

caco-2细胞模型的建立及药物吸收研究的初步应用 口服给药是一种传统的给药方法，相对安全、方便，容易被患者接受。目前口服药物制剂的开发已成为药学界的研究重点。用于药物吸收的试验方法包括体内和体外两部分。体外试验能提供较直观的药物吸收过程的证据,因此被广泛采用。近十几年来,国外已普遍采用组织细胞模型作为药物筛选的工具,其中包括Caco-2细胞(the human colon adenocarc- inoma cell lines)单层模型。Caco-2细胞系来源于人类结肠癌及直肠癌,普通培养条件下即可在有孔的多聚碳酸酯膜上自发的分化为肠上皮细胞单层,因此可以模拟体内小肠上皮细胞层,然而体外试验得到的数据必定与体内试验有差异。为缩小这种差异,使体外与体内的数据有更好的相关性,预测药物在体内的吸收过程,为临床筛选药物提供依据,我们于2003~2004年建立了Caco-2细胞模型,并对该模型的单层完整性、通透性以及P-糖蛋白(P-gp)的表达进行了验证。现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 荧光黄、普奈洛尔、乙腈标准品 DMEM培养基(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青);非必需氨基酸(NEAA,GIBCO);胰蛋白酶(上海生工);荧光黄、普奈洛尔以及维拉帕米标准品(均购自Sigma);乙腈(色谱纯,Dikma);其余试剂均为分析纯。 Waters高效液相色谱系统:Waters 515泵、Waters 717 plus自动进样器、Waters 2487紫外检测器、Waters Millennium 32色谱数据处理软件。 1.2 dmem培养基 Caco-2细胞来源于美国细胞、菌种库(ATCC)。在37℃,含5%CO2的环境中培养。DMEM培养基含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸以及100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素双抗液。细胞接种在12孔Transwell板上,接种密度为2×105/孔,第1周隔天换液,后2周每天换液,生长至21d左右细胞形成紧密的单层。装置图参见文献。 1.3 胞单层顶生型检测 ①单向转运试验:将荧光黄和普奈洛尔分别加于Caco-2细胞单层顶端(A面),分别于3h及1h后从基底端(B面)取样进行检测。②双向转运试验:将维拉帕米分别加于Caco-2细胞单层的A面或B面,2h后从B面或A面取样进行检测。 1.4 细胞模型的验证试验 1.4.1 细胞电泳的测定 在每种药物的转运试验进行前及结束后,均用细胞电位仪(EVOM)测定在pH为7.2~7.4时的跨上皮细胞电阻(TEER),确定单层细胞的紧密性与完整性。 1.4.2 caco-2细胞单层端基底端转运试验 荧光黄和普奈洛尔分别用作Caco-2细胞单层模型的细胞旁转运及跨细胞被动转运的标记物;将其跨膜通透率作为检测细胞单层紧密性与通透性的标准。在pH为7.2~7.4的情况下,进行荧光黄和普奈洛尔从Caco-2细胞单层顶端(A面)→基底端(B面)的转运试验。试验前,细胞用HBSS(pH7.4)液小心冲洗3次,最后一次在37℃培养箱中孵育0.5h后轻轻吸干孔内HBSS,以清除细胞表面对测定有干扰的物质。根据试验设计,在A面分别加浓度为荧光黄330μg/ml及普奈洛尔100μmol/L;B面加HBSS。放入37℃孵育,分别于给药后3h和1h收集B面的溶液,测定其中的药物浓度,计算通透率,并与文献报道值比较。 1.4.3 测定药物的透明率 先将维拉帕米(经典的P-gp底物)作为底物,验证P-gp对其外排作用;然后加入酮康唑(P-gp的强抑制剂),检验酮康唑对维拉帕米外排的抑制作用。在未加或加入酮康唑的条件下,同时进行维拉帕米转运试验(A面→B面和B面→A面),测定药物浓度,分别计算通透率。转运试验方法同1.4.2所述。 1.5 测试指标 1.5.1 黄光裕浓度 采用荧光分光光度计法(F-3010荧光分光光度计,美国),激发波长为427nm,发射波长为536nm。 1.5.2 不锈钢柱、流动相、相 采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱柱为Hypersil BDS C18(I.D.4.6mm×150mm,5μm)不锈钢柱(大连依利特公司生产);流动相为25mM磷酸二氢钾缓冲液∶乙腈(60∶40),用磷酸调pH至2.5;流速1.0ml/min;检测波长290nm;进样量20μl;采用维拉帕米150μg/ml作为内标。 1.5.3 缓冲溶液ph 采用HPLC法。色谱柱同前;流动相为50mM磷酸二氢钾缓冲液∶乙腈(60∶40),用磷酸调pH至3.6;流速1.0 ml/min;检测波长278nm;进样量20μl;采用普奈洛尔13.2μg/ml作为内标。 1.6 ac0 根据下式计算:Papp=[(dC/dt (V)]/(A×C0)。C0为加药侧的药物初始浓度,dC/dt