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基于mvilles-双2-羟基苯亚甲基邻苯二胺合铜修饰碳基网络电路菌免疫传感电极的制备与检测 1 修饰电极的制备 感染嫌疑人的卵（p24）是众所周知的。其检测方法包括酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫荧光分析(IFA)等。其中 ELISA 法最常用,但灵敏度不高,“窗口期”长,假阳性率高。后两种方法灵敏可靠,但所需仪器昂贵,操作复杂,不适宜于基层医疗部门作p24现场筛查。安培免疫传感器具有极高的灵敏度和特异性,适合于构建痕量p24的快速检测技术,有望缩短艾滋病“窗口期”并降低检测成本。但目前该类传感器在临床上应用还存在一些不足:一是通常采用酶标抗体结合在电极表面,通过酶催化反应(如HRP酶对H2O2催化)引起测试体系电信号变化进行测定。由于酶昂贵且固定于电极表面易失活,导致电极使用寿命降低;二是当电极上的抗原/抗体发生结合后生成物很难除去,其表面无法更新,测定数次后需要重新修饰,费时繁琐;三是常见的电极材料(如金、玻碳等)价格昂贵,制备成本高。N,N′-双(2羟基苯亚甲基)邻苯二胺合铜(CuRb)具有催化H2O2的特性,可替代HRP酶。碳纳米管和纳米金常被用于固定抗原/抗体分子而制备生物探针,进而将其修饰到电极表面,可获得高灵敏度、检出时间显著缩短的安培免疫传感器。闵丽根等采用纳米金、多壁碳纳米管等合成了纳米复合物,用其固定癌胚抗原(CEA)抗体制得了灵敏度和稳定性俱佳的CEA传感器,但该类传感器仍无法实现更新。Fe3O4/Au组装型金磁纳米微粒(简称GMP)兼具Fe3O4的超顺磁性和胶体金的生物相容性,可用于抗体固定并易于实现磁性分离,近年来在生化分析中应用日渐广泛。如合成MWNTs/GMP复合粒子(MWNTs-GMP)并包被p24抗体(anti p24),由此制备的“磁性碳纳米管探针”可方便地在外磁场作用下在电极表面吸附解吸,获得的免疫传感器可再生,由此可大大简化检测探针在电极上修饰过程。丝网印刷碳电极(SPCEs) 可批量生产,具有成本低、电极面积可控等突出优点,非常适合于构建廉价的一次性安培免疫传感器。 本研究采用CuRb修饰,在SPCEs电极上构建了H2O2传感器(SPCE︱CuRb),并合成了MWNTs-GMP,用以包被p24抗体;通过外加磁场将MWNTs-GMP/anti p24探针吸引到SPCE︱CuRb表面,制备了电极表面可更新的磁控HIVp24无酶型一次性安培免疫传感器, 并用于HIV患者血清检测。 2 实验部分 2.1 raingx射线荧光检测 CHI-660B电化学分析工作站(上海辰华公司);三电极集成的SPCEs(西班牙DropSens公司,工作电极为修饰电极,参比电极为Ag/AgCl电极,对电极为碳电极); Hitachi S-3400N型能谱扫描电镜(日本Hitachi公司);S2 RANGER X射线荧光光谱仪(德国Bruker公司);NdFeB稀土强磁铁(杭州强磁铁器材有限公司,磁场感应强度为0.1～1.0 mT)。 1 mg/L的鼠抗人HIV p24抗原及其单克隆抗体(anti p24)试剂盒(美国Epitomics公司);牛血清蛋白 (BSA, 美国Sigma公司); CuRb参照文献制备; Fe3O4/Au微粒(5 mg/L,粒径(50±1.2)nm); 吸附抗体量:25 mg人IgG/mL(陕西北美基因股份有限公司,浓度为5×107个/mL); 羧基化多壁碳纳米管MWNTs(深圳纳米港公司,纯度大于90%); Nafion溶液(上海河森电气公司); HIVp24抗体阳性灭活血样4份, 阴性血样6份(南方医科大学南方医院检验科)。实验用水为超纯水(美国Millipore公司),其它试剂均为分析纯。 2.2 spce—SPCE|CuRb/MWNTs-GMP/antip24免疫电极的制备和表征 MWNTs-GMP/anti p24:将羧基化MWNTs浸入到0.36 mol/L 乙二胺溶液(pH=7.0的PBS,含50 mmol/L碳二亚胺作偶合剂)中胺基化。将胺化的MWNTs浸入5 g/L GMP溶液(pH 6.5,室温)中反应2.5 h,即得5 mg/L MWNTs-GMP溶液。按照GMP说明书的抗原包被步骤和包被量,在5 mL pH 7.0,0.02 mol/L Tris-HCl中加入5 μL 5 mg/L MWNTs-GMP与100 μL 1 μg/L anti p24,25 ℃下振荡反应20 min,磁性分离弃上清液。再加入5 mL PBS和5 μL牛血清蛋白BSA(1000 U/mL)。25 ℃下搅拌1 h,以封闭未包被anti p24的GMP表面,磁性分离弃上清液。重复操作3次,即得最终产物,制备过程如图1。 免疫电极:在SPCE电极(3.0 cm×2.0