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消化内镜活检管路生物膜去除方法的探讨 现在，胃镜是诊断和治疗胃肠道疾病的重要手段。美国每年有2000万人进行胃肠内科手术。合理严格的内镜清洗消毒是内镜手术能够安全开展的根本前提。生物膜目前被认为是引起内镜感染的一个重要因素, 内镜清洗过程中有效去除生物膜是能够有效避免内镜相关感染的重要措施。本研究通过抽取临床使用的内镜活检管路样本, 检测里面生物膜生长情况, 并通过不同方法去评价临床使用的清洗剂对内镜管路中生物膜的清除效果, 为内镜生物膜相关问题的研究方法和解决方法提供指导和参考。 1 zity公司的检血药检血检查 试剂:LB肉汤培养基及琼脂 (Promage生物制剂公司) , 0.1 M PBS, 1% 锇酸, 乙醇, 100%丙酮, 100%醋酸异戊酯, 0.3%结晶紫, 20 mmol/L MES, BCA蛋白检测试剂盒 (Promage) , 多酶清洗剂 (RMEC, Rapid multi-en-zyme cleaner, 3M) , 无酶清洗剂 (Intercept, Mediva-tors) , 无菌蒸馏水。器材:CO2临界点干燥仪、离子溅射仪、stereoscan260型扫描电镜、循环式灌流器、超声波振动器 (Olympus ultrasonic cleaner, Olym-pus) 、酶标仪 (Bio-Red, 美国) 。 临床胃镜活检管路组 (共计10根) , 只做扫描电镜检查, 从内镜活检管路先端每距离15cm截取1.5cm的片段去做扫描电镜检查。对照组:内镜活检管路生物膜模拟物2cm×18段, 处理方式为仅用0.1MPBS, 浸泡10min。Intercept组:内镜活检管路生物膜模拟物2cm×18段, 处理方式为无酶清洗剂Intercept按照1∶300比例配置后, 浸泡10min。RMEC组:内镜活检管路生物膜模拟物2cm×18段, 处理方式为RMEC (Rapidmulti-enzyme cleaner) 按照1∶400比例配置后, 浸泡10min。 1.3 tsb-bca法 取少量斜面保种的大肠埃希菌菌株, 接种于无菌Muller-Hinton肉汤培养基获得纯种菌液。用倾注平板法, 调整细菌浓度为106CFU/ml备用。 取配制好的菌悬液2ml, 加入到含200ml TSB的三角烧瓶中, 使其菌液浓度为102CFU/ml备用。用带有通气孔 (过滤层0.22mm) 的塞子将烧瓶塞住, 通过通气孔延伸到瓶底, 另一个软管在TSB液面上。通过蠕动泵和软管子将内镜管路连接组成管道系统, 保持在370C的条件, 用蠕动泵在10 ml/min的流量下循环, 4h/d。每日更换TSB, 连续培养5d。第6天用500ml无菌生理盐水以10ml/min的流速冲洗管腔去除管腔内壁的浮游菌。培养完后的内镜管路取下, 每15cm长度截取1.5cm的样品备用。 转移至无菌EP管的内镜管路材料以1% 锇酸固定1h, 0.1mol/L PBS冲洗两次, 每次15min, 系列乙醇脱水, 100%丙酮脱水15min, 醋酸正戊酯置换, CO2临界点干燥, 离子溅射仪喷金, 然后用扫描电镜观察、拍照。 将材料置于含1ml 0.1 mol/L PBS的无菌EP管中超声振荡 (38~47kHz, 10 min) 使生物膜从管壁材料上剥离, 吸取其中100μl PBS, 以一定比例稀释后分别以0.1ml量加入无菌平皿中, 并倒入冷却至50 ℃的M-H琼脂20 ml, 混匀, 冷却后置37 ℃ 孵育24h, 观察菌落生长情况, 作菌落计数。 将材料分别加入5ml灭菌PBS, 浸没于40KHz (20 ℃) 超声波清洗器中超声清洗6.5min后, 漩涡震荡2min。取待测样品100μl分别同2ml BCA反应液混合, 60度加热30min, 冷却后测量562nm吸光值。 各组管路片取出以后, 用PBS冲洗, 分别放置到50 ml的离心管中, 分别加入25 ml, 0.3%的结晶紫溶液浸泡90min后, 取出用PBS冲洗3次, 风干。然后将样本分别放入离心管中, 并加入1 ml, 95% 乙醇后再50KHz超声5min后, 取200μl按照1∶50体积比和95%乙醇混合后测量540nm下吸光值。 生物膜清除率%= (1-试验组/对照组) ×100%。 数据录入和管理通过Excel软件, 使用SPSS10.0软件对数据进行统计分析, 采用配对t检验, P0.05为差异有统计学意义。 2 生物膜的生长情况 总共送检了10根胃镜活检管路, 扫描电镜结果显示, 有4根活检管路中生物膜生长情况复杂, 见图1A;看到明显的细菌结构形状, 见图1B;胃镜活检管路完全干净的表面, 见图1D;模拟胃镜活检管路生物膜生长的材料表面生物膜生长非常明显, 见图1