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利用第一腹肢移植雌青蟹纳精囊的研究 蟹类人工繁殖是综合育种、雌性育种、精细诱导育种、二型育种分类等基础。它也是研究甲壳动物精神器特征的有效手段。有两种收割技术，即外部人工精细和内科医生。关于甲壳动物的人工育种问题，clark等人在1973年取得了一些进展。然而，由于难以理解卵的生理成熟的技术问题，以及卵离体培养的困难，即使在生产上也很难形成规模。persyn（1977）成功移植后代。 已有的蟹类人工授精都是体外受精,对于蟹类精荚移植的体内人工授精,国内外则无相关报道.本文首次报道锯缘青蟹(Scylla serrata)体内人工授精的初步实验结果,并对其进一步研究作了展望. 1 材料和方法 1.1 青蟹及精荚的人工移植培养 青蟹于2001年7至10月和2002年7至10月购自厦门水产市场,选取健康,性腺发育饱满青蟹及部分未成熟青蟹,用于精荚的人工移植研究.青蟹饲养于厦门五通1m3的4口小培育池中,实验用水采用二级沙滤,硅藻土过滤. 1.2 传统拉制器推制 模仿青蟹雄性第一腹肢,根据其在交配中的作用机理,采用常规滴管为材料,利用酒精灯灼热拉制一个前端弯曲、侧扁、管径大小相近的人工交配器(图1). 1.3 青蟹人工授精缓冲液 采用无钙离子的人工海水(Ca2+-FSW)( Leung-Trujillo Lawrence,1987)作为青蟹人工授精的缓冲液.缓冲液中加入适量庆大霉素.缓冲液主要用于稀释、保护精液和冲洗器具. 1.4 青蟹精荚的提取 精荚人工移植时采用1∶1的性别配比,挑取成熟的雄性青蟹,解剖获取贮精囊处的精荚.精荚在用Ca2+-FSW配制的庆大霉素液中轻微漂洗,然后放于1.5cm3的离心管中.同时吸取200μm3左右的上述缓冲液于每一个离心管中.用另一只滴管头挤压贮精囊壁,释放精荚中的精子使其呈游离状.同时迅速将雌蟹腹部打开,用庆大霉素液冲洗阴道开口表面.将人工交配器插入阴道开口处适当深度,立即吸取精荚或精液滴入人工交配器中,马上用洗耳球吹气,推进精荚及精液于纳精囊中.整个过程在3～5min内完成,需两人协作.青蟹人工授精完成后干露放置一段时间,再放于池中. 1.5 青蟹的覆盖 人工授精蟹的培育池底用砖块在中间分隔,一半铺沙,另一半空出.在池底铺沙部分靠墙侧搭建多个蟹窝.每天投饵于没有铺沙处,饵料主要以杂色蛤为主,投饵量视青蟹摄食状况而定.保持水质的清新,隔天排换水1次,排完水后要干露1～2h,再加水.同时取适量海边滩泥于池中,减少水的透明度.青蟹产卵后,从培育池中及时将抱卵蟹转移到大的圆形孵化桶中,开口用泡沫板覆盖.移入前用50mg/dm3高锰酸钾浸泡15～20min.不投饵,保证定期换水和冲气量,定期检查胚胎发育状况. 2 结果 2.1 亲蟹产卵及胚胎发育情况 单边纳精囊人工植入精荚,三组实验除因实验操作或运输不当而使青蟹死亡的外,共计14只青蟹,其中有8只青蟹产卵(表1).同时与自然交配的亲蟹产卵情况进行对比,自然交配的亲蟹总数为8只,其中有6只在短期内正常产卵,表2记录了自然交配的3只蟹产卵及胚胎发育情况.两者对比最明显的差异是人工授精的亲蟹的抱卵量低于正常交配蟹抱卵量,约为后者的1/3～1/2左右.镜检纳精囊发现两边的精子基本保持完整,植入精荚的一边含有较多的细菌和原生动物,部分精子受渗透压作用已呈膨大状. 2.2 亲蟹和未成蟹的产卵和生长 2002年8～10月挑选性成熟的青蟹及未交配但接近性成熟的青蟹进行实验,性成熟亲蟹双边纳精囊植入精荚,3只青蟹成功产卵.而12只未交配的蟹,未能成功产卵,但授精后一直维持着较高的活力,大都因为长期养殖,营养和水环境恶化导致细菌感染,脱皮不遂引起死亡. 2.3 精荚移植后的纳精囊形态变化 人工授精后的青蟹纳精囊发生强烈反应.无论是未交配性腺不成熟雌蟹,还是性成熟雌蟹,纳精囊都会产生黑色素物质.组织学研究表明黑色素物质为均质的嗜曙红分泌物,不成熟雌蟹含量较多.精液颗粒大部分被黑色素分泌物溶解,少量被挤压至纳精囊一边[(图版Ⅰ- 1)附在刊末,下同].精荚和精液移植到性腺未成熟的青蟹中,精液基本不会分解(图版Ⅰ- 3),精荚被纳精囊上皮大量吞噬.另有大量精荚游离在腔中不被裂解(图版Ⅰ- 5).采用2∶1雄雌比移植的精荚量远不如自然交配输入的精荚量.一个特殊现象是不成熟蟹精荚移植两个月后,上皮内吞的精荚会进入到纳精囊外周的动脉中.部分发生在阴道部,阴道上皮增生(图版Ⅰ- 7),尤其是会进入到支配纳精囊的主干神经的神经下动脉中(图版Ⅰ- 8). 精荚移植到性腺成熟青蟹中,大部分被裂解并消化,和原有精液颗粒混合在一起.性腺成熟青蟹移植的精荚大部分裂解,少量保持完整状态,移植精液和精荚能够进入到输卵管处(图版Ⅰ- 2,图版Ⅰ- 4).性腺成熟青蟹精荚移植后的纳精囊上皮脱皮严重,部分上