高效液相色谱法测定人血浆中黄体酮血药浓度.docxVIP

高效液相色谱法测定人血浆中黄体酮血药浓度 黄体酮是一种天然的酪氨酸酶，具有广泛的生理效果和临床治疗作用，历史悠久。目前,黄体酮新的应用正不断地开发出来,其中使用黄体酮治疗输尿管结石和肾绞痛的报道日益增多。国内外应用黄体酮治疗输尿管结石据报道排石率可达96%,生理作用和体内代谢规律的研究还在不断深入。生物样品中黄体酮含量的测定方法以放射免疫法为主, 可测定时,黄体酮与其代谢物及多种结构相似的甾体激素有交叉免疫反应, 近年有液-质联用的测定方法,但是价格昂贵。笔者建立了一种简单、快速、高效、灵敏的HPLC法测定人血浆中黄体酮的药物浓度,用于临床上血药浓度监测以及人体药代动力学研究,为黄体酮的合理用药提供依据。 1 材料和方法 1.1 millnn小气样色谱站 Waters高效液相色谱仪(600型低压梯度泵,717型自动进样器,486型紫外检测器,Millennium32色谱工作站);XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);Barnstead Thermolyne Shaker;MTN-2800D氮吹仪 (AutoScience);Sigma 3K18高速冷冻离心机;高速离心机(美国雅培公司TDX仪附件)。 1.2 苯乙腈,环丙腈 黄体酮对照品(广州白云山明兴制药有限公司,批号050701,纯度100.1%);炔诺酮片(上海信宜康捷药业有限公司 规格:0.625 mg,批号:061108);乙腈(色谱纯,Merck);其余试剂均为分析纯。 1.3 流动相、柱温度 色谱柱:Hypersil ODS2(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:乙腈:5 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(pH=8)=63:37;柱温:室温;流速:1.0 ml/min;检测波长:240 nm。 1.4 血液中药物浓度的测量 1.4.1 黄体酮储备液的制备 精密称取黄体酮对照品适量,置于10 ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得1 mg/ml的黄体酮储备液。将黄体酮储备液以甲醇稀释,配制浓度为0.25、1.25、2.5、10、20、30、40 μg/ml的黄体酮标准溶液。 1.4.2 内标溶液的配制 取炔诺酮片剂适量,置于10 ml容量瓶中,加入适量甲醇, 37℃恒温振荡使片剂完全溶解后过滤,吸取所有滤液,用甲醇稀释至10 ml,得浓度为62.5 μg/ml的内标溶液。 1.4.3 h-环己烷-2-环己烷体系 精密吸取血浆样品500 μl,置10 ml具塞离心管中,分别加入25 μl内标液、10 μl 0.5 M NaOH 溶液和2.5 ml环己烷,旋转震荡15 min后4500转/min离心10 min,转移上清液至1.5 ml离心管中,N2流吹干,残渣加入75%甲醇75 μl,漩涡混合30 s使其溶解,10800转/min离心5 min取上清液20 μl进样。记录色谱图,以黄体酮峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比Y代入标准曲线计算黄体酮血药浓度。 1.4.4 准溶液浓度 精密吸取空白血浆500 μl,置于10 ml具塞离心管中,分别加入不同浓度的黄体酮标准溶液20 μl,漩涡混匀30 s,使其浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/ml。按“血浆样品处理与测定”方法操作,以不同浓度黄体酮系列溶液的As和Ai来计算Y,以Y值为纵坐标,黄体酮浓度C为横坐标进行线性回归。 1.4.5 血药浓度计算 分别于500 μl空白血浆中加入低、中、高3种浓度的黄体酮标准溶液20 μl,漩涡混匀30 s,使其血药浓度分别为0.01、0.4、1.6μg/ml。按“血浆样品处理与测定”方法操作,将黄体酮峰面积(As)与内标峰面积(Ai)之比Y代入标准曲线计算黄体酮血药浓度,以测得值与加入值之比计算方法回收率。以1 d内测得的黄体酮浓度计算日内精密度,以1周内5次测定的黄体酮浓度计算日间精密度。 2 结果 2.1 空白血浆及血浆样品的色谱图 在上述色谱条件下,血浆中内源性杂质均不影响黄体酮和内标物的分离测定,黄体酮与内标保留时间分别为10.4 min和5.0 min。空白血浆及血浆样品色谱图见图1。 A:空白血浆;B:血浆样品;1、炔诺酮;2、黄体酮 2.2 峰面积比及回归方程 黄体酮在10～1600ng/ml 浓度范围内,血药浓度与峰面积比有良好线性关系,其回归方程为:Y= 0.00267C+0.0204(r=0.9998)。以信噪比S/N=3:1计,黄体酮最低检测浓度为6 ng/ml。 2.3 方法回收率 高、中、低三种浓度的方法回收率分别为(91.0±5.0)%、(99.7±2.7)%、(97.5±1.6)%,平均方法回收率为(96.1±3.1)%(n=15)。3种浓度的日内RSD≤5.7%,日间RSD≤6.4%。结果详见表