peg-rhil-6放射性碘标记的分离纯化及生物学活性测定.docxVIP

peg-rhil-6放射性碘标记的分离纯化及生物学活性测定 白细胞介素-6（il-6）是由非巴比细胞产生的一种多功能细胞因子。它可以在身体免疫、骨髓造影剂和炎症反应中发挥重要作用。他是细胞网络的重要成员。目前在欧美和日本等发达国家以IL-6治疗血小板减少症为目的的研究,已进入临床试验阶段。但IL-6在体内由于蛋白质水解而呈现出低稳定性,同时由于快速的肾排泄和广泛的组织分布其生物半衰期很短。为了达到期望中的临床效果,通常采用高剂量和频繁给药。有关研究发现,聚乙二醇化重组人白细胞介素-6(PEG-rhIL-6)能够降低蛋白质的肾排泄率和保护其不受蛋白酶的水解,从而延长蛋白质的生物活性并保证它的临床效果。我国有关单位开发的PEG-rhIL-6药物也正处于临床前研究阶段。为使PEG-rhIL-6早日应用于临床,本研究分别用常规氯氨T和改进的双相氯氨T法对PEG-rhIL-6进行放射性碘标记,对标记物分离纯化并进行生物活性鉴定,制备出高纯度、比放射性适中的PEG-rhIL-6同位素标记物,为进行PEG-rhIL-6药代动力学方面的研究提供必要条件和保证。 1 材料和方法 1.1 细胞株 Na125I(放射化学纯度99.9%),Amersham公司产品;PEG-rhIL-6(纯度大于95%),成都生物制品研究所提供,生产许可证号09;7TD1细胞株,成都生物制品研究所提供;垂直板式电泳槽,北京六一仪器厂;UV-754分光光度计,上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂;FT-2008 γ免疫测定仪,西安二六二厂;5408R高速冷冻离心机,德国eppendorf公司;超滤离心管,Millipore公司;酶标仪,Bio-tek公司。 1.2 方法 1.2.1 硅烷化反应时代 常规氯氨T法标记参照尹伯元法。双相氯氨T法标记参照本室标记长效促红细胞生成素的方法,放免试剂盒的标准小瓶1个,瓶盖2个(不锈钢丝穿过瓶盖,折弯以悬挂滤纸片)。用有机硅溶液对反应瓶、吸头进行硅烷化以防吸附。取滤纸1张,用1mol/L NaCl溶液浸泡30min,烘箱干燥,剪成7mm×40mm大小的纸片。在反应瓶里依次加入0.1 mol/L pH7.4磷酸缓冲液50μl、Na125I 37MBq、PEG-rhIL-6 50μg。取制备好的滤纸片1片,在其表面滴加15μl氯氨T溶液,悬挂在折弯的不锈钢丝上,迅速盖上反应瓶盖。每10min换滤纸片一次,共换5次。反应过程中间歇轻轻震荡保证反应液充分混匀。反应结束后加入5μl偏重亚硫酸钠终止反应。 1.2.2 标准物质的测定 取标记反应后样品2μl,用三氯乙酸(TCA)沉淀法测定标记率。 1.2.3 放射性化学纯度检测 选用Sephadex G-75层析柱对碘化反应混合液进行分离纯化。离心超滤法纯化标记物参照《蛋白质技术手册》。纯化后的标记物用三氯乙酸沉淀法测定放射化学纯度。同时采用时液SDS电泳法检测其电泳行为和放射化学纯度。将碘标记PEG-rhIL-6样品所在凝胶切割成4mm宽的胶条,分别放入试管中在FT-2008 γ计数器上测定放射性,并绘制扫描图谱。 1.2.4 标准曲线的绘制 采用考马斯亮蓝染色法,参照Bradford检测法,以牛血清白蛋白作为参考品,在UV-754分光光度计上测出A595值,绘制标准曲线。使用标准曲线定量柱层析及离心超滤的蛋白质浓度。 1.2.5 生物活性的测定 利用体外培养IL-6依赖7TD1细胞株,用MTT比色法测定125I-PEG-rhIL-6生物活性。 2 结果 2.1 放射性比活度测定 标记反应完毕后取2μl样品,用三氯乙酸沉淀法测定标记率。根据125I蛋白( Bq/μg)= 所用125I总放射性(Bq)×125I标记率/所用蛋白总量(μg),计算出125I-PEG-rhIL-6的放射性比活度,结果见表1。 2.2 标记化合物的分离和精制 2.2.1 游离碘离子峰 柱层析法分离纯化双相氯氨T碘标记PEG-rhIL-6。第一峰为蛋白峰,第二峰为游离碘离子。共收集19管,放射性已极低,接近本底。对常规氯氨T碘标记PEG-rhIL-6的分离不够理想,仍为两个放射峰(见图1)。 2.2.2 超滤器纯化 将标记后的PEG-rhIL-6加入超滤器后连续离心3次,样品得到高度纯化并浓缩,回收体积为20~30μl,可按实验要求补充体积到需要量。 2.3 化学纯度的测定 2.3.1 三氯乙酸沉淀法测定了辐射化学纯度 分别用柱层析法和超滤离心法对标记蛋白分离纯化,得到标记蛋白的放射化学纯度均高于99%,结果见表2。 2.3.2 sds-pg法测定辐射化学纯度 2.3.2. 双相法标记的peg-rhil-6与非标记品电泳行为的比较 SDS电泳染色结果表明,PEG-rhIL-6的电泳图谱显示了2个条带,Rf值分别为0.2