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PAGE PAGE 7 实验一：多粘菌素B的发酵培养 一、实验目的：1掌握多粘菌素B生产菌株的分离纯化和保藏。 2 掌握多粘菌素B接种，扩配培养和摇瓶发酵技术。 3 掌握多粘菌素B在3L发酵罐上中的培养技术。 4 掌握HPLC或杯碟法的检测技术。 二、实验原理：多粘菌素B是由多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolym．yxa) 产生的一种由氨基酸和脂肪组成的碱性锁环状多肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌有较强的抑制或杀菌作用，多粘类芽孢杆菌为好氧发酵，本实验主要采用摇瓶和发酵罐进行发酵培养。 三、实验材料与方法： 1）菌种：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus，polymyxa)，-80℃冰箱，甘油管保藏（本实验室保存）。 2）培养基组成及培养条件： (1)斜面培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨8%，牛肉粉0.3%，NaC1 0.5%，琼脂1.5%，消后pH 6.8。30℃培养24h。配200ml，试管装5ml×3支，余下装一个三角瓶。单孢子液涂平板，培养24小时，得母斜面。挑母斜面上的单菌落传子斜面培养24小时。 (2)种子培养基：葡萄糖2.5%，蛋白胨0.55%，牛肉粉0.7%，NaC1 0.3%，pH=6.8。配200ml，装25ml/250ml瓶×4瓶，200rpm、30℃培养24h。移出标准：pH 6.6-6.8，OD650=1左右。 (3)发酵培养基：可溶性淀粉3%（先糊化），葡萄糖1.5%，玉米浆0.3%，(NH4)2SO4 0.2%，NaCl 0.06%，KH2PO4 0.08%，MgSO4 0.02%，CaCO3 1%，泡敌0.02%，消前pH 7.5-8.0，消后pH 6.8。30℃。 摇瓶发酵：配200ml，装50ml/250ml瓶×4瓶，接种2ml，200rpm，培养48h。 3L发酵罐：装2 L，接种量1%，300-650rpm，通气比≥1.0vvm（0.10-0.25m3/h），DO≥10%，pH≥6.3，培养48h。 培养基灭菌：121℃、15min。 注意点：淀粉一定要单独糊化；先调pH，最后加CaCO3。 3）实验准备（每组）： 1ml移液管15支，5ml移液管5支，培养皿1包，20玻璃珠+20ml生理盐水装三角瓶，9ml生理盐水试管8支，6ml细菌培养基试管3支，15ml细菌培养基试管3支，牛津杯12个。种子培养基250ml三角瓶4个，发酵培养基250ml三角瓶4个。 4）实验仪器： 3L发酵罐，灭菌锅，pH计，天平，磁力搅拌器，显微镜，分光光度计。 四、检测方法： 1）样品制备： 取发酵液10 ml，加热至100℃，离心或过滤，取上清，用于效价检测。 2）杯碟法（生物检定） 枯草芽孢杆菌/大肠埃希菌作检定菌，在培养皿中倒入15 ml普通细菌培养基，待其凝固后再倒入6 ml混有枯草芽孢杆菌孢子的细菌培养基，凝固后即得到细菌平板。取发酵液离心（6000 rpm，4 min）得到的上清液200 μl，注入牛津杯（直径为7.5 mm）中，于37 ℃培养箱中培养16-18 h后，测量抑菌圈的直径，通过与相近浓度标样的对比，计算产物的生物效价。（每组3皿，培养基21ml/皿 生物检定培养基（g/L）：酵母浸膏粉 1，葡萄糖 5，硫酸铵 1，琼脂 20。90 mm培养皿下层倒入15 ml培养基，上层为混有100 μl检定菌液的6 ml细菌培养基。 检定菌的制备：枯草芽孢杆菌的培养（20g葡萄糖、15g蛋白胨、0.5g牛肉膏、5g氯化钠，1L蒸馏水，36℃振荡培养14h），加20颗玻璃珠，放置摇床200rpm，10min，制成单孢子悬液（107个/ml），4 ℃冰箱保存备用。（30ml/250ml瓶×1瓶） 多粘菌素B标准溶液配制：0.6 g/L、0.9 g/L、1.2g/L、1.5 g/L。 3）HPLC分析条件： 色谱柱：YMC-Pack ODS-A（5μm, 12nm） 250×4.6mmI.D. 或：Kromasil 100-3.5-C18 (4.6x150mm) 流动相：31.4mM 硫酸钠-磷酸（pH2.3）/乙腈（80/20） 流速：1.0ml/min，检测波长：215nm，温度：30℃ 每次进样量：20μl（0.5mg/ml） 实验二：硫酸多粘菌素B的提取制备实验 一、实验目的： 1、了解有机溶剂萃取与反萃取的原理； 2、掌握萃取的操作要点； 3、了解多粘菌素B提取制备的工艺过程； 4、学会如何根据产物的特性，选择和确定提取方法。 二、实验原理： 多粘菌素B系由多粘芽胞杆菌产生的一组多肽类抗生素，属于胞外产物。常用其硫酸盐，结构如下图，为白色结晶性粉末，易溶于水，微溶于乙醇，有引湿性。在酸性溶液中稳定（pH2.0～7.0），其中性溶液在室温放置一周不影响效价，100℃时放