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cd62l-cd62l+细胞的体外抗原刺激能力 异基因血浆移植（hct）是治疗血液系统恶性疾病的最有效方法，但由于植物性抗主细胞（gvwd）的严重并发症，其疗效和广泛使用仍在一定程度上受到限制。GVHD的概念最早是由Billingham提出, 是指含有供者大量的免疫细胞的移植物被输注到免疫力低下的宿主体内, 这些免疫细胞识别受者体内的主要/次要组织相容性抗原, 发动细胞免疫反应。在这个过程中, 移植物中的初始T细胞识别宿主抗原并被激活, 活化后的T细胞攻击宿主的靶器官是GVHD发生的基础, 但移植物中的成熟T细胞具有抗肿瘤效应, 因此也是移植后免疫重建的重要组成部分, 它在移植过程中扮演着双重角色。许多研究试图在两者之间找到一个平衡点, 选择性清除T细胞是一个很好的切入点。因此近年来, 各种研究选择性清除T细胞的方法成为热点。例如, 采用蓖麻免疫毒素去除部分T细胞, 阻断T细胞的共刺激信号, 自杀基因HSV-TK的研究等等, 但这些方法始终未能在临床上广泛开展。 CD62L是初始T细胞 (即从未接触到特异性抗原的一类T细胞) 表面的归巢受体, 它可以介导循环系统中的初始T细胞归巢于外周淋巴组织, 在这里初始T细胞被相应抗原激活, 成为成熟 (记忆) T细胞, 其表面的CD62L分子表达下调, 成为CD62L-的T细胞。因此T细胞可根据有无接触过特异性抗原而分为初始T细胞和记忆T细胞, 即CD62L-和CD62L+T细胞。假如供者的免疫系统从未接触过受者抗原, 那么导致GVHD的宿主反应性T细胞应该属于CD62L+的初始T细胞。既然初始的T细胞被受者同种特异性抗原激活, 在攻击靶器官, 引发GVHD中起主要作用, 那么若选择性输注成熟记忆T (CD62L-) 细胞, 从理论上讲是可以避免GVHD的发生的。本研究旨在通过体外实验来观察CD62L-和CD62L+两群细胞在识别抗原等方面的特性。 材料和方法 培养液、细胞器和t细胞分离柱 C57BL/ 6 健康小鼠, 6-8 周龄, 雌雄不拘, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供;红细胞裂解液、胰蛋白酶、RPMI 1640培养液均购自武汉凌飞公司;胎牛血清为Gibco公司产品;淋巴细胞分离液购自武汉大风公司;PE直标小鼠CD62L流式抗体、PE标记大鼠抗小鼠CD80、CD86、FITC-dextran为美国BioLegend公司产品;rmIL-2购自Biosource公司;CFSE、重组小鼠IL-4、GM-CSF购自美国PeprOTech公司;T细胞分离柱、人CD4分子为美国RD公司产品;EL4细胞系购自同济医学院免疫实验室。 细胞因子和cd钢的制备 断颈处死小鼠, 无菌取双侧股骨和胫骨。用剪刀剪掉股骨、胫骨的两端, 吸取PBS 液, 分别从股骨、胫骨的两端冲洗出骨髓细胞, 至髓腔变白为止。经200目的筛网过滤, 去除红细胞后调整细胞浓度为 2 × 106/ml, 接种于6孔培样板, 每孔2 ml, 于培养箱中孵育3小时后, 吸弃上层细胞悬液, 用RPMI 1640培养液轻轻洗3 次洗去非黏附细胞, 获得黏附细胞, 分别加入RPMI 1640培养液 1 ml, 细胞因子 mrGM-CSF 、mrIL-4 各20 ng/ml, 隔天更换1/2体积培养液并加入相当首次浓度半量的细胞因子。用倒置显微镜逐日观察细胞生长状况。 于培养第3天收集DC, 加入PE标记的CD80, CD86各5 μl, 4℃避光孵育30分钟, 用流式细胞仪检测表面CD80, CD86表达情况。至培养7天收集未成熟DC, 加入FITC-dextran 1 mg/ml, 置于37℃温育30分钟、用PBS洗脱多余荧光染料。用荧光显微镜观察抗原摄取情况。 冻融法提取蛋白 取对数生长期的EL4细胞, 用PBS洗涤3遍, 调整细胞浓度为1×109/L, 放置-70℃液氮10分钟, 再37℃水浴复温, 反复冻融5次, 2 500×g离心10分钟, 收集上清, 4℃ 10 000×g离心30分钟。取上清液, 用0.2 μm微孔滤膜过滤除菌。用冻存管保存于-20℃备用。并用BCA法测定蛋白浓度 (0.062 mg/ml) 。以浓度为100 μg/ml负载DC。 dc细胞培养 收集第5天DC, 调整细胞浓度为5×105/ml, 种于6孔板, 每孔取细胞悬液1 ml, 实验分为2组。一组为DC细胞+ LPS+冻融抗原100 μg/ml, 另一组为DC细胞+ LPS+hCD4 1 ml, LPS浓度为1 μg/ ml。2组DC置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱, 孵育48小时。收集少量DC, 检测其表面CD80, CD86表达水平。 t细胞悬液的制备 断颈处死小鼠, 取脾脏置于筛网上, 经 100目及200目的筛网碾磨过滤,