血凝试验分析和总结.docx

血凝试验(HA) 定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设 计的试验称血凝试验 (HA) 血凝抑制试验(HI) 定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素， 则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑 制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。 原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳 性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA 和 HI 试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖 2.05g、柠檬酸钠 0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠 0.42g，加蒸馏水至 100mL，散热溶解后调 pH 值至 6.1，69kPa 15min 高压灭菌，4℃保存备用 1%鸡红细胞液的制备 采血 用注射器吸取阿氏液约 1mL，取至少 2 只 SPF 鸡（如果没有 SPF 鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约 2～4mL，与阿氏液混合，放入装 10mL阿氏液的离心管中混匀。 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经 1500～1800 r/min 离心 8 分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经 1500～1800 r/min 离心 8 分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复 2 次以上过程后，加入阿氏液 20 mL，轻轻混合成红细胞悬液， 4℃保存备用，不超过 5 天。 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过 5 天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8 分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入 9 倍体积(mL)的 PBS，用吸管反复吹吸使 PBS 与红细胞混合均匀。 1%鸡红细胞液 取混合均匀的 10%鸡红细胞悬液 1 mL，加入 9 mLPBS，混合均匀即可。 抗原血凝效价测定（HA 试验，微量法） 在微量反应板的 1 孔～12 孔均加入 25μLPBS，换滴头。 吸取 25μL 病毒悬液加入第 l 孔，混匀。 从第 1 孔吸取 25μL 病毒液加入第 2 孔，混匀后吸取25μL 加入第 3 孔，如此进行对倍 稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取 25μL 弃之，换滴头。 每孔再加入 25μL PBS。 每孔均加入 25μL 体积分数为 1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入） 振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置 40min 后观察结果（如果环境温度太高，可置 4℃ 环境下反应 1 小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。 结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果将板倾斜（45 度左右），观察血凝板，判读结果： ++++：红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集 ＋＋＋：红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈 ＋＋：红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块 ＋： 红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块 －：红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集 能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为 1 个血凝单位（HAU）。 注意！ 对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效 血凝抑制试验（HI 试验 微量法） 根据 3 的试验结果配制 4HAU 的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点， 终点稀释倍数除以 4 即为含 4HAU 的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为 1:256， 则 4HAU 抗原的稀释倍数应是 1:64（256 除以 4）。 在微量反应板的 1 孔～11 孔加入 25μL PBS，第 12 孔加入 50μL PBS。 吸取 25μL 血清加入第 1 孔内，充分混匀后吸 25μL 于第 2 孔，依次对倍稀释至第 10 孔，从第 10 孔吸取 25μL 弃去。 1