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利用ssr技术筛选高粱抗丝寄生虫病菌3号生理小种基因标记 0 抗病品种选育 [研究意义]高粱是世界上第五大谷物。它具有抗旱性、抗旱性、抗旱性、耐盐碱性等优点。广泛应用于珠江三角洲89个国家的干旱、半干旱和低地。这是世界上最古老的种植植物之一。然而,高粱在大面积生产过程中,面临着虫害和病害的威胁。丝黑穗病(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clinton)是遍布世界各地的重要高粱病害,发病率经常在15%—20%,高者达80%以上,造成严重减产。通常人们在生产上主要采取轮作倒茬、药剂拌种、选育抗病品种等措施控制病害,其中选育抗病品种是目前最有效的方法,如何选育具有持久抗病性的品种已成为中国乃至世界所面临的重大课题。【前人研究进展】选育抗病品种是一项非常复杂的工作,传统的方法是基于作物表现型进行抗病亲本选择,育种效率不高。随着DNA分子标记技术的兴起,为植物抗病虫害的研究开辟了新天地。目前许多科研单位,利用RFLP、RAPD、AFLP及SSR等标记技术,对水稻、小麦、玉米、、大豆、高粱等作物的主要农艺性状基因进行了标记和定位研究,构建基因图谱,并取得了较大的进展。然而,在高粱抗丝黑穗病基因的分子标记研究上,中国仍属空白,国际报道也较少。【本研究切入点】防治高粱丝黑穗病最有效的途径莫过于应用抗病品种。高粱抗丝黑穗病育种主要采取杂交与回交相结合,通过接种鉴定进行选择的方法,这使得育种进程受到田间鉴定的限制;而且,由于受到环境条件(如温度)的影响,接种效果不一定理想。利用分子标记技术可实现实验室内对高粱抗丝黑穗病的选择鉴定,从而提高工作效率和准确性,节省时间和资金,打破季节限制。本试验基于辽宁省农业科学院多年来对高粱丝黑穗病遗传机制的研究基础:高粱丝黑穗病菌3号生理小种的抗性主要表现质量性状遗传,利用SSR标记多态性高、标记呈显性和共显性、稳定性好、技术难度低等优点,寻找与高粱丝黑穗病菌3号生理小种抗性基因紧密连锁的SSR标记,免去对丝黑穗病的田间接种鉴定,只要对苗期叶片进行分析,即可实现对抗丝黑穗病的选择。【拟解决的关键问题】本试验在以往研究基础上,通过对保持系间、恢复系间、以及不育系与恢复系间三类群体亲、子代高粱材料的抗丝黑穗病情况分析,探讨高粱材料对丝黑穗病菌3号生理小种的抗性遗传规律;并以此遗传规律为依据,应用SSR标记技术找到与抗丝黑穗病基因紧密连锁的分子标记,并定位于染色体上,从而为生产上利用分子标记辅助选择技术,为抗丝黑穗病优良品种的选育提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 抗池、感池的制备 亲本材料:对丝黑穗病免疫的7050B、2381R;对丝黑穗病高感的Tx622B、矮四。 F2群体:共组成2个F2分离群体,群体1为恢复系分离群体。2002年以抗病恢复系2381R为母本,以感病恢复系矮四为父本,经人工去雄有性杂交,得到F0种子;2003年将F0代种植并自交,得到F1种子,2004年获得2381R/矮四F2群体。抗池、感池分别由F2代63株抗病株叶片及35株感病株叶片提取的DNA混匀而成,制备时每株均取2 ng DNA。 群体2为保持系分离群体。2002年以感病保持系Tx622B为母本,以抗病保持系7050B为父本,经人工去雄有性杂交,得到F0种子;2003年将F0代种植并自交,得到F1种子,2004年获得Tx622B/7050B F2群体。抗池、感池分别由F2代75株抗病株叶片及33株感病株叶片提取的DNA混匀而成,制备时每株均取2 ng DNA。 高粱丝黑穗病菌粉:高粱丝黑穗病菌3号生理小种菌粉。 1.2 菌土覆盖方法 采用土壤接种法接种丝黑穗病病菌,播种前4—5d,将从上一年的病穗上收集来的丝黑穗病菌3号生理小种厚垣孢子粉与过筛的细土混合成0.6%的菌土(重量比),用塑料布盖好菌土,防止菌土风干。播种时,亲本材料采用随机区组设计,顺序排列,无重复,2行区,行长4 m,行距0.6 m,穴播,每穴留双株;杂交组合F2随机排列,每组合25行,穴播,每穴留双株,每穴用100 g菌土覆盖种子,覆土4—5 cm镇压,待植株抽穗后调查植株发病情况。 在中国,高粱对丝黑穗病的抗病能力是根据人工接种条件下被鉴定材料的发病率进行划分,具体分级标准如表1所示。 1.3 ssr分析 1.3.1 引用产品 1.3.2 taq酶2.3 采用CTAB法提取植物的基因组DNA,运用选取的109对SSR引物进行扩增。反应体积为20μL(d NTPs 10 mmol·L-11.5μL,10×buffer2.0μL,Mg Cl22.5μL,Primer 1.5μL,Taq酶5 U·μL-10.5μL,模板DNA 2.0μL,超纯水10.0μL)。反应程序为:94℃5 min;94℃30 s,54℃30 s,72℃60 s,共35