hplc法测定人血浆中伊立替康及其代谢物喜树碱的浓度.docxVIP

hplc法测定人血浆中伊立替康及其代谢物喜树碱的浓度 伊利洋康是一种半合成喜树碱衍生物。它可以特异性地抑制dna的异构酶，阻止异构酶恢复断裂的dna链，并抑制细胞分裂。在临床研究中,发现伊立替康对晚期直肠癌有肯定疗效。在CPT-11的代谢过程中,被肝脏、肠道或血浆中的羧酸酯酶水解,生成一个有活性的代谢物,即7-乙基-10-羟基喜树碱(以下简称SN-38)。其余代谢通路则是主要通过CYP3A4进行,代谢产物包括通过CYP3A4代谢产生的APC、NPC等等。在CPT-11的一系列代谢物的活性研究中,发现SN-38活性较高,其他代谢物则活性低或无活性。 伊立替康及SN-38在临床上能产生一系列严重的不良反应,因此建立一套简便精确的CPT-11与SN-38测定方法十分重要。目前主要的检测手段是通过高效液相色谱与质谱联用测定伊立替康,但一般不检测活性代谢物SN-38。因使用质谱成本较高,在临床上暂时无法大规模推广使用,且未测定SN-38。因此建立一种简单方便、又满足检测要求的测定方法更具实际意义。本文建立了同时检测CPT-11与其活性代谢物SN-38的HPLC方法,简便精确,可以在临床上推广使用,现报道如下。 1 方法 1.1 药物、试剂和仪器 Waters1525二元高效液相泵;Waters 2475多波长荧光检测器;Waters 2707自动进样器(Waters Corporation);Breeze2 HPLC System。 伊立替康(化学对照品,SIGMA-ALDRICH,批号059K1163);SN-38(化学对照品,SIGMA-ALDRICH,≥98%);喜树碱(化学对照品,中国药品生物制品检定所,批号 100532-200401);醋酸(国药集团化学试剂有限公司,批号≥99.5%);醋酸铵(国药集团化学试剂有限公司,≥98.0%);甲醇(Fisher Scientific,99.9%);乙腈(Fisher Scientific,99.9%)。 1.2 流动相、梯度配比 色谱柱:Luna 5u CN 100A(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱(Phenomenex);流动相:醋酸铵缓冲盐(50 mmol·L-1,0.3%醋酸)与乙腈梯度洗脱。见表1。梯度配比:A:乙腈,B:醋酸铵缓冲盐(50 mmol·L-1,0.3%醋酸);进样量:10 μL;柱温:40 ℃;检测波长:激发波长=368 nm,发射波长=CPT-11=432 nm,SN-38=535 nm。 1.3 标准曲线的制备 以0.01 mol·L-1盐酸液-乙腈(2∶3)为稀释液,CPT-11,SN-38与内标CPT用DMSO溶解后用稀释液稀释。CPT-11与SN-38以浓度比24∶1混合为工作溶液,浓度分别为:CPT-11 469,938,1 875,3 750,7 500,15 000,30 000,60 000 nmol·L-1;SN-38 20,39,78,156,312,625,1 250,2 500 nmo·L-1。 分别取上述工作溶液10 μL置于1.5 mL EP管中,加入90 μL空白人血浆,涡旋混合;加入10 μL的内标溶液(CPT 1 μmol·L-1),涡旋混合;然后加入10%高氯酸-乙腈(1∶2)沉淀剂90 μL,振荡混匀,以12 000 r·min-1的速度离心10 min,取上清溶液备用。即制得血浆样品标准曲线,标准曲线8个点浓度范围为:CPT-11 46.9～6 000.0 nmol·L-1;SN-38 2.0～250.0 nmol·L-1。 2 结果 2.1 色谱图的测定 在上述实验条件下,CPT-11,CPT与SN-38的保留时间分别为:SN-38(4.8 min),CPT(5.3 min),CPT-11(9.5 min),分离度R=1.68符合要求。色谱图见图1。另取5份空白血浆做空白对照试验,杂质峰对待测物和内标无干扰,专属性较好。 2.2 标准曲线方程 在本实验方法下,SN-38定量范围为2.0～250.0 nmol·L-1,标准曲线方程为Y=0.034+0.036X(W=1/C),r=0.998。CPT-11的定量范围为46.9～6 000.0 nmol·L-1,标准曲线方程为Y=0.116+0.013X(W=1/C),r=0.998。 2.3 血浆中药物浓度检测 定量下限是标准曲线上的最低浓度点,其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内,RSD应小于20%。我们考察样品浓度SN-38为2.0 nmol·L-1,CPT-11为46.9 nmol·L-1,低于4个半衰期时血浆中药物浓度。发现SN-38准确度为(99.3±15.6)%,RSD为15.67%。CPT-11的准确度为(94.