5-h2和5-h3受体亚型在5-h诱导外周痛反应和痛调制中的相互作用.docxVIP

5-h2和5-h3受体亚型在5-h诱导外周痛反应和痛调制中的相互作用 各种炎症介质包括h-和p物质（sp）、5-羟色胺（5-ht）、缓冲液（bk）、前列腺素（pg）和三丙烯酸（parkam）。当被组织损伤或炎症释放时，5-ht是一种非常重要的外围疼痛物质。相应的受体可分为7种类型和至少14种类型。5-ht3受体为配体门控离子通道，其他受害者为g蛋白偶联体受体。目前有的报道表明了在初级感觉神经元上5-HT受体亚型的分布:背根神经节神经元上的分布为,5-HT1B,D,F,5-HT2A,C,5-HT3,5-HT4,5-HT5A,B,而5-HT1A,E,5-HT2B,5-HT5,5-HT6则缺乏;三叉神经节神经元上的分布为,5-HT1A,B,D,5-HT2A,5-HT3,5-HT4,5-HT6。这些受体亚型在5-HT引发的伤害性信息形成和调制中的作用及其相互关系尚不很清楚。 本文采用全细胞膜片钳技术在分离的大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)神经元上发现,5-HT2受体激动剂α-methyl-5-HT能增强5-HT3受体介导的电流,而5-HT1受体激动剂UH-301则无此作用。我们在电生理资料结果的基础上应用行为学方法在整体动物水平上同时观察和探讨5-HT2和5-HT3受体在外周初级感觉神经末梢伤害性信息的产生和调制中的相互作用及其可能机制。 1 材料和方法 1.1 电生理实验 1.1.1 神经节的剪碎 TG细胞急性分离方法概述如下:雄性SD大鼠100～150g(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供),击昏断头后,迅速切开颅顶部皮肤暴露出颅骨,沿矢状缝打开颅骨,切除大脑后即可见到位于颅底硬脑膜下的三叉神经节及其分支。小心剥离硬脑膜后迅速取出双侧三叉神经节置于氧饱和的DMEM(Dubecco’s Modified Eagle’s Medium)内,pH7.4,渗透压为340 mOsm/kg。在体视显微镜下用精细弹簧剪及游丝镊仔细去除周围的结缔组织被膜,将清除干净的三叉神经节尽可能地剪碎。置培养瓶内,然后加trypsin(typeⅡ-S,Sigma)0.5g/L,collagenase(typeⅠA,Sigma)1.0g/L,DNase(typeⅢ,Sigma)0.1g/L,在恒温震荡水浴器(35°C,80 counts/min)中孵育30～40 min。孵育毕,加入1.25 mg/ml Soybean trypsin inhibitor(typeⅡ-S,Sigma)以中止酶的消化作用。将上述机械分离的三叉神经节细胞转移至一35 mm培养皿内,放在倒置显微镜的载物台上静置至少30 min。 1.1.2. 灌流用外液 全细胞膜片钳记录所用仪器为CEZ-2400型膜片钳放大器(日本Nihon Kohden生产)。所充内液成分为(mmol/L):KCl(CsCl)140, CaCl21, MgCl22, HEPES 10, EGTA 11, ATP 4,电极电阻2-4MΩ,灌流用外液成分为(mmol/L):NaCl 150,CaCl22.5,KCl 5,MgCl21,HEPES 10,D-glucose 10。在电极与细胞膜之间形成高阻 (1～5MΩ)封接后,进一步将膜吸穿,调节电容和串联电阻补偿,置钳制电压于-60MV,膜电流应用低通滤波(10 kHz,-3 dB),电流直接描记于笔录仪上。 1.2 疼痛行为反应的研究 1.2.1 试验进度及方法 本研究所用动物为100～150 g的SD雄性大鼠,均由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。全部试验均在动物清醒状态下进行。大鼠随机以每6只为一组分组喂养,室温维持在(22±2)℃并遵循12∶12 h的昼夜节律。试验前一小时,随机取一只动物放入一20 cm×20 cm×30 cm有机玻璃制成的观察箱内让动物熟悉试验环境。试验开始时,在后肢脚掌底部皮下注射测试药物以诱导急性疼痛,然后立即放入观察箱内观察、记录痛行为反应。以注药侧后肢的抬举动作作为痛反应的观察、判断指标,以后肢明显抬离箱底的持续时间(s)作为测量依据,以每5 min为一时间节段,依据不同的实验需要,每次试验共观察45 min到55 min不等。一般每只动物只试验一次,如果两侧后肢均需使用,则前后两次连续试验的间隔时间为一周。试验完毕后,将动物处死。 1.2.2 单次给药剂量试验 把在观察箱内已熟悉试验环境的大鼠诱入一布制口袋,让其呼吸畅通,又能暴露后肢。当动物平静下来后即可用30 G针头将50 μl试验用药注入单侧后肢脚掌底部皮下。所用药物均为Sigma公司生产。试验前将5-Hydroxytryptamine (5-HT, serotonin)、 Cyproheptadine (Cyp, 5-HT2受体选