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利用单细胞PCR方法生产人源化单克隆抗体的探索的中期报告 本实验旨在利用单细胞PCR方法生产人源化单克隆抗体。在前期实验中，已完成了以下步骤： 1. 对小鼠进行免疫，获得小鼠B细胞产生的抗体。 2. 采集小鼠脾细胞，进行单细胞分离。 3. 对单个B细胞进行PCR扩增，获得B细胞的单克隆DNA。 4. 将单克隆DNA插入重组蛋白表达载体并转染至CHO细胞系中。 5. 筛选表达抗体的CHO细胞株并验证其抗体特异性和亲和力。 现在，我们开始进入中期实验。 1. 生产抗体 在前期实验的基础上，我们可以利用上述获得的CHO细胞株来大规模生产单克隆抗体。具体操作步骤如下： 1.1 冻存CHO细胞株 将CHO细胞株在生长期收集。用10％ DMSO 储存90％ FBS 冰冻细胞。在液氮中储存。 1.2 解冻CHO细胞株 将每个细胞株解冻在37°C温水中，用德尔比科液体NPC（Biofluids）冲洗以去除DMSO和FBS。 用DMEM培养细胞，差不多24小时。 1.3 改变细胞培养条件 在细胞密度达到80％左右时，取出细胞，将其移至无血清状态的培养基中（例如Opti-MEM），并用适当的载体向其中加入特异性的激动剂（如GNXG / NSDN，2.5mg / mL）。重新培养48小时。 1.4 收获培养基 在细胞密度达到80％左右时，用一次性注射器收集细胞培养基。 1.5 纯化抗体 将收获的培养基通过亲和层析柱（例如Protein A / G层析柱）进行纯化。 2. 测定抗体特异性和亲和力 为了确定抗体的特异性和亲和力，我们需要进行以下实验： 2.1 ELISA 使用ELISA（酶联免疫吸附试验）测定纯化的抗体与目标抗原的结合活性。 2.2 Western blot 使用Western blot测定纯化的抗体与目标蛋白的结合活性。 2.3 免疫组织化学 使用免疫组织化学检查抗体在组织中的表达。 3. 生产人源化单克隆抗体 我们将使用已生产的小鼠单克隆抗体作为模板，利用已建立的单细胞PCR方法，进行人源化修饰。具体步骤如下： 3.1.设计人源化引物 设计人源化引物，将小鼠抗体的CDR（补体决定性区域）序列转换为人源化序列。 3.2.扩增人源化单克隆DNA 使用单细胞PCR，扩增人源化单克隆DNA。 3.3. 转染CHO细胞株 将人源化单克隆DNA插入重组蛋白表达载体并转染至CHO细胞系中。 3.4. 筛选表达抗体的CHO细胞株 筛选表达人源化单克隆抗体的CHO细胞株并验证其特异性和亲和力。 本实验目前处于实验中期，我们正致力于获得高特异性和高亲和力的人源化单克隆抗体。