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抗苗勒管激素与抗苗勒管激素对小鼠颗粒细胞上卵刺激素受体mrna表达的影响 由于卵巢衰竭，女性的更年期发育导致闭经、卵巢萎缩、卵巢刺激素增多和雌激素水平下降。这是一种严重影响女性身心健康的卵巢功能低下疾病。临床表现见不同程度的潮热多汗、阴道干涩、性欲下降等绝经前后症状,并且导致患者骨质疏松、心血管疾病等绝经后疾病提前发生,该病发病率占成年女性的1%~3%,发病机制尚不清楚。近年来卵巢局部调控因子成为研究的热点,抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)是重要的卵巢局部调控因子之一,AMH与颗粒细胞上卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)的关系成为关注的问题。2010年10月至2011年6月本实验通过体外分离培养小鼠原代颗粒细胞,加入不同浓度的AMH于培养液中,观察各组间颗粒细胞上FSHR mRNA的表达情况。报告如下。 1 材料和方法 1.1 小鼠和小鼠抗小鼠抗体 孕马血清促性腺激素(宁波第二激素厂),DMEM/F12培养基(美国HyClone公司),无支原体胎牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公司),胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、青霉素、链霉素(美国Sigma公司),FHSR山羊抗小鼠抗体(Santa Cruz Biotechnology),荧光PE标记二抗,Trizol,5×逆转录 buffer,5×SYBR Green Ⅰ PCR buffer,dNTPs,MMLV,Taq 酶;CO2培养箱(日本SANYO),低温高速离心机(德国Eppendorf公司)体视显微镜(德国Leica公司),普通光学倒置显微镜(日本OLYMPUS),ABI 3900 台式高通量 DNA 合成仪,ABI 9700 PCR仪,ABI 7500全自动荧光定量PCR仪。 1.2 实验动物 5~7周的SPF级昆明雌性小鼠,体重18~22 g,由广东省医学实验动物中心提供。 1.3 方法 1.3.1 组织病理学观察 选15只5~7周的昆明雌性小鼠,每只小鼠注射15~20单位的孕马血清促性腺激素,48~54 h后颈椎脱臼法处死。处死后的小鼠放入75%的酒精中浸泡1~2 min后,解剖取双侧卵巢,把卵巢立即放入预冷的无菌PBS中,用无菌PBS冲洗3遍,在解剖显微镜下剔除卵巢上的包膜、脂肪组织,再用PBS洗2~3遍,在解剖显微镜下用1号针头刺破卵泡,释放颗粒细胞。把卵巢组织和混有颗粒细胞的PBS液放入离心管中,1 000 r/min离心5 min后弃上清液,用含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸悬浮细胞,放入培养皿中,加含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸到4 mL,用吸管轻轻吹打分散细胞,放入37℃、5% CO2培养箱中消化30 min,期间吹打2~3次。消化完毕后用含胎牛血清的全培养基终止消化,1 000 r/min离心5 min,弃上清液,用全培养基(85 mL DMEM/F12+15 mL胎牛血清+1 mL青-链霉素)悬浮,制备成单细胞悬液。将细胞稀释成1×106·mL-1的细胞悬液,接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,36~48 h后第1次换液,以后隔天换一次培养基。 1.3.2 小鼠细胞抗能力检测 (1)形态学观察:在倒置显微镜下观察细胞的形态学特征并拍照;(2)FSHR表达鉴定颗粒细胞的纯度:取生长旺盛的第4天的细胞,倒掉培养基,用无菌PBS洗3遍,用含0.25%胰酶-0.02%的乙二胺四乙酸消化5~10 min,光学显微镜下观察细胞的变化,待大部分细胞变圆形后立即加入含胎牛血清的全培养基终止消化,1 000 r/min离心5 min后弃上清液,加入PBS制成1×106·mL-1的细胞悬液,分成两管,实验管中加入FSHR山羊抗小鼠抗体和二抗羊抗鼠IgG-FITC,对照组只加二抗,室温下孵育30 min,上机检测;(3)免疫荧光鉴定颗粒细胞:细胞爬片后,用4%多聚甲醛固定10 min (固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮),PBS漂洗2次,5 min/次,然后用1% BSA 封闭30 min,再加入 1% BSA稀释的一抗FSHR山羊抗小鼠抗体(1∶200),于 37℃杂交 2 h后,PBS漂洗2次,5 min/次,加入 1% BSA稀释的二抗IgG-PE,于 37℃杂交1 h,PBS漂洗 2 次,5 min/次,最后用5 μg/mL DAPI 染色 2 min,用抗淬灭封片剂封片,于荧光显微镜下观察并拍照。 1.3.3 加入不同浓度的amh,并以推动各施细胞的表达为前提 将细胞制成1×106·mL-1的细胞悬液,接种于6孔板中,每孔种2 mL,培养24 h后换液,并加入不同浓度的AMH,分组如下:(1)空白对照组;(2)AMH 5