基因工程工程菌构建.pptx

基因工程工程菌构建; 1,3、丙二醇就是目前国际上公认得六大石化新产品之一,其主要功能就是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯得单体。1,3一丙二醇得生产方法有化学合成法和微生物转化法,但从自然界中筛选得微生物厌氧发酵甘油生产l,3一丙二醇还存在产物生产周期长和转化率低等问题,目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此,利用基因工程技术构建高产菌株备被认为就是今后得发展方向。;1,3-丙二醇性质;1,3-丙二醇用途;1,3-丙二醇基因工程菌构建得预期目标;1,3-丙二醇基因工程菌构建得路线; 1,3、丙二醇生物合成途径 l,3一丙二醇就是一种典型得甘油发酵产物,并未发现其可由其她有机底物厌氧转化而来。甘油作为唯一碳源和能源,她可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应,氧化途径中产物与糖类发酵产物一致,并产牛供细胞牛长所必需得ATP,在某些产物形成得同时释放还原力NADH;还原途径则消耗氧化途径中多余得还原力,生成1,3一丙二醇 。 ;一、大肠杆菌JMl09得构建及其表达; ;;6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中得废液。 (7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中,静置1 min后,6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中得废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min,尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱,将其套入一个干净得1、5 mLEppendorf离心管中,加入适量洗脱缓冲液,常规50此,室温放置2、5min后,6000 r／min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。 ;大家有疑问的，可以询问和交流;(二)、大肠杆菌感受态细胞得制备 (1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过夜。 (2)取0、5mL培养液于50mLLB培养基中37℃振荡培养至OD值O、3—0、4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中,轻轻摇晃,使菌液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1、5mL)中,Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min,然后静置2min,冰水中迅速弃上清,加入预冷得CaCl2400uL, ; ;(三)、转化大肠杆菌;(四)、大肠杆菌JMl09基因工程菌得构建;(五)、酶活力测定 ;(六)、1,3、丙二醇含量得测定;二、重组质粒pUC—tac-dhaT得构建及其与pEtac—dhaB—tac-yqhD在大肠杆菌JMl09中共表达;实验材料 菌种:E coliJMl09(pEtac-dhaB—tac-yqhD)为本研究“第二章构建保存得;质粒pUCl9, pEtac由本实验室保藏:dhaT基因从克雷伯氏菌中 试剂和工具酶:质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒 工具酶、抗生素 公司、华美生物 ;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公布得序列, 。 ; 引物: 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公布得序列,设计片段pEtac、dhaTPCR所需引物:Ps:5’-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3’: P6:5-ACC CAGAATGCCTGGCG、3’。引物两端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位点。;实验条件和方法 PCR反应体系及反应条件:PCR反应体系:在0 5 mL Eppendorf管中按顺序加入以下试剂:10×buffer 5 m,2 5mmol／LdNTP4lLl,MgCl24IlI,上下游引物各1 IIl,模板DNA2 pl,脚酶1 itl,ddH20 32m,总体积50 pl。 1、3一丙二醇氧化还原酶dhaT得反应条件: 94℃预变性5min:变性90 s,54℃退火l 5min,72℃延伸l 5rain,循环35次;72℃保温10min。 ; (1)大肠杆菌基因工程菌得构建 将来源于克雷伯氏菌得基因片段dhaT连入载体pEtae,以得到得重组质粒pEtac-dhaT。经酶切得到片段tac-dhaT连接到pUCl9上,以得到得重组质粒pUC-tac-dhaT。将基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化大肠杆菌KcoliJMl09。 (2) 1,3、丙二醇氧化还原酶得酶活力测定 测定1,3-丙二醇氧化还原酶得酶活。酶活测定根据250C条件下NAD+还原成NADH得速率来定量。酶活单位定义为1国际单位(1u)等于每分种还原1lJmol底物NAD+或生成1“raol产物NADH得酶量。;四、重组菌coliJMl09(pEtac—dhaB—tac-yqhD,