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分光光度法测定糖色中4-甲基咪唑的研究 1 -甲基咪唑的测定 焦糖作为一种食用色素，广泛应用于饮料、饮料、黄瓜、风味饮料、蔬菜、甜点、咖啡、奶碱、糖、糖药等行业。由于在生产过程中,常加入硫酸铵做催化剂而有4-甲基咪唑副反应产物生成。4-甲基咪唑具有惊厥作用,若含量较高,对人有害,可以令人发生痉挛。焦糖色的国家标准GB8817-2001中明确规定4-甲基咪唑的含量不得高于0.02%。目前,现行国家标准方法中对焦糖色中4-甲基咪唑的测定采用的是薄层法,此外还有纸层析法,都是利用目视对其进行定量,不可避免地带来较大的误差。气相色谱法测定4-甲基咪唑也见报道,但该法是用于4-甲基咪唑合成产物中的分析测定。目前,利用分光光度法对食品中4-甲基咪唑的分析报道甚少,本文建立了采用分光光度法测定食品添加剂焦糖色中4-甲基咪唑的方法,获得满意的分析结果。 2 实验部分 2.1 重氮化试剂及标准品 SPECTRONICRGENESYSTM5型分光光度计(美国) 氯仿-无水乙醇混合溶剂(80∶20) 10%碳酸钠溶液 0.05N硫酸溶液 无水碳酸钠 10%碳酸氢钠溶液 重氮化试剂: a. 0.5%对氨基苯磺酸的2%盐酸溶液 b. 0.5%亚硝酸钠溶液(现配) 将a,b两溶液等量混合即为重氮化试剂。 4-甲基咪唑标准溶液:准确称取4-甲基咪唑0.1000g,置于100mL容量瓶中,加10%碳酸氢钠溶液10mL,然后加水至刻度,此液1mL含1mg4-甲基咪唑。 4-甲基咪唑如果是粗制品要进行精制:取4-甲基咪唑置于苯溶剂中,在88～90℃水浴上溶解之后,在室温下自然结晶,过滤后自然挥干,置干燥器中过夜,然后装入棕色试剂瓶中,加塞,置冰箱中保存。 2.2 样品测定 2.2.1 无水乙醇法提取碳酸钠 ①称取5.00g样品,加水15mL后再加入10%碳酸钠溶液15mL,置于250mL分液漏斗中,加氯仿-无水乙醇混合溶剂80mL,剧烈振摇4～5分钟,待完全分层后,将下层氯仿-无水乙醇提取液收集于250mL具塞三角瓶中,上层水层再用氯仿-无水乙醇混合溶剂70mL提取一次,合并提取液。 ②将提取液加15g无水碳酸钠剧烈振摇60次,用快速滤纸过滤于250mL分液漏斗中,并用氯仿约30mL分三次洗涤三角瓶和滤纸,洗液合并于滤液中。 ③在滤液中加入0.05N硫酸20mL,剧烈振摇150次,待分层后,收集水层,再加入0.05N硫酸15mL剧烈振摇60次,合并水层,加入少许活性炭,微温,过滤于50mL容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀。 ④准确吸取1mL上述溶液,置于10mL比色管中,加重氮化试剂1mL和10%碳酸氢钠溶液0.5mL,充分混匀,反应1min,加水至刻度,摇匀。放置10～15min,于440nm处测定吸光度,以试剂空白作对照。 2.2.2 g-甲基蒂唑的合成 准确吸取4-甲基咪唑标准溶液5mL,加水10mL,再加10%碳酸钠溶液15mL,以下操作方法按2.3.1中①～③进行。准确吸取上述处理液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL(分别相当于0.00mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mg 4-甲基咪唑),置于10mL比色管中,加水至1mL,加重氮化试剂1mL和10%碳酸氢钠溶液0.5mL,充分混匀,反应1min,加水至刻度,摇匀。放置10～15min,于440nm处测定吸光度。以4-甲基咪唑毫克数为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。 2.2.3 -甲基咪唑含量测定 X=CW×150×1000×100×0.1/A610X=CW×150×1000×100×0.1/A610 式中:X—样品中4-甲基咪唑含量(%); C—测得样品溶液的吸光度从标准曲线查得相应的含量(mg); W—样品称样量(g); A610—样品在610nm处的吸光度; 0.1/A610—折算成色度为0.1时的含量; 3 结果与讨论 3.1 橘黄色分析法 将样品在微碱性环境中用有机溶剂提取,经硫酸酸化处理,与对氨基苯磺酸起偶合反应,生成橘黄色到棕红色偶合物,采用分光光度法进行比色定量。反应方程式如下。 3.2 吸光度的影响 按实验方法,在350nm～700nm处进行波长扫描,结果表明:吸光度在410～440nm内逐渐增加,至440nm处达到最大。之后,吸光度逐渐下降,因而本实验中选择λ= 440nm作为工作波长。 3.3 标准工作曲线 在试验条件下测定绘制4-甲基咪唑标准工作曲线,其线性方程为:C=0.0717A+0.0007,线性相关系数为0.999,检出限为1.4ug。 3.4 准确度与标准偏差回收率的实验 取焦糖色样品,按试验方法重复测定六次,其RSD为3.5%。另取两个样品,按试验方法测定并作加标回收实验,结果