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神经束路追踪技术 －辣根过氧化物酶法 1 n 神经束路追踪技术是利用神经元轴 浆运输(axoplasmic transport) 现象的示(追)踪法，主要用于研 究神经元间广泛的神经纤维联系。 n 轴浆运输包括从胞体向轴突及其终 末的顺行运输和从轴突及其终末向 胞体的逆行运输。 2 神经束路追踪法主要有辣根过氧化 物酶示踪技术、荧光素示踪技术、 同位素示踪技术及顺行示踪技术等。 目前较常应用辣根过氧化物酶法进 行神经束路追踪，本章对其作重点 介绍。 n n 3 1971年Kristenson和Olsson首先报道 HRP可被神经末梢摄取，经逆行轴浆运 输至神经元胞体后，可用组织化学方 法显示胞体的位置，从而创建了辣根 过氧化物酶 ( horseradish peroxidase, HRP) 追踪神经元法。 n 4 n HRP法是基于神经元轴浆运输的生理 现象，即将HRP注射至中枢神经系 统或周围神经的一定部位，HRP可被 神经末梢以胞饮的方式摄入，逆行 运送至胞体，经过一定时间后取相 应的部位固定、切片，然后用组织 化学方法显示HRP的标记。 5 n 该方法的问世，得到神经科学界 的高度评价。它结束了自Marchi (1886年) 开始长达近一个世纪 的唯一用银染法追踪选择性溃变 纤维的年代，在神经束路及其功 能的研究中具有划时代的意义。 6 HRP的特性： n HRP是是从辣根中提取出来的一组同 功酶的混合物，为糖蛋白，含有其组 织化学活动所必需的正铁血红素族， 在H2O2作用下催化某些化合物 (成色 原) 而氧化产生可见的反应物。 n 分子量为40，000道尓顿，分子半径 约为3.0nm。 7 HRP的细胞外给药法： n 加压注射法 微量注射器或微玻管注射，常用。 n 离子透入注射法 离子透入技术是以负载电荷的化学 分子或示踪剂注入组织的方法。 8 HRP的结合与扩散: n 终末摄取 电镜显示，注入HRP后，依次出现于胞 饮小泡、膜性囊和小管以及多泡体和致 密体内。较长时间后， HRP从这些成分 中消失，说明这些细胞器与示踪剂的结 合、存储及溶酶体降解有关。 由神经终末摄取的HRP直接与它的突触 活动有关。 9 n 轴索摄取 轴索暂时受损 (如注射区) 或经挤 压与切断而受到严重损伤时，即可 摄取HRP并填充于损伤处的远端和近 端。 n 逆行性轴索输送 通过细胞器经轴索逆行运输到神 经元胞体，与微管的完整性有关。 10 n胞体摄取与顺行性轴索输送 神经元胞体直接摄取HRP的现象几 乎发生于注射区或其附近，或在高 浓度HRP处的神经元。 11 n HRP标记的微管、小囊和小泡被运 送到胞体并积聚于核周质高尔基复合体 附近，即互相融合成较大的结构 (如溶 酶体) ，最后全细胞及树突都为HRP溶 酶体所充满。 早在HRP被输送到胞体的前三天， 由于溶酶体降解作用而使HRP含量显著 减少，在4-8天大部分溶酶体内已无HRP。 12 nHRP输送到细胞体的命运 13 HRP示踪的常用方法 (TMB法) n 基本原理： 神经组织的冰冻切片或振动切片在 含H2O2的TMB (四甲基联苯胺)溶液 中孵育，组织内之HRP与H2O2结合成 (HRP-H2O2) 络合物，此络合物可 氧化供氢的TMB，使之形成深兰色沉 淀物，沉积在HRP周围。 14 n TMB法特点： 灵敏度高，产物在光镜下易观察，于 明视野下颗粒呈蓝至深蓝色，暗视野 呈金色；不宜电镜检查。改良TMB法可 避免其缺点 (反应产物过度的结晶形 成、反应的不稳定性、易褪色消失等) 。 15 n实验步骤： 麻醉动物 导入HRP 动物存活 灌注固定 取材 切片 组织化学反应 显微镜观察 16 1.麻醉大鼠：2%戊巴比妥 (40mg/kg)腹 腔注射。麻醉不宜过深，以免苏醒过慢， 影响HRP被神经元摄取及在其内的运输。 2.注入HRP：动物麻醉后，分离坐骨神经， 用微量注射器将1%CB-HRP(霍乱原B亚单 位结合辣根过氧化物酶) 2.5ul 17 缓慢注入坐骨神经。注射后原位留针 10min，缝合切口，将大鼠置于原环境中 继续存活。 3.存活期：指HRP注入后，动物需存活一 段时间，以利于HRP的摄取、运输及积累。 存活期的长短依赖于运送速度、运送距 离及胞体内HRP在溶酶体的降解速度，一 般为24-72小时。 18 4.灌注固定：动物麻醉同前，开胸，经 左心室-主动脉插管，灌注温的 (37℃) 生理盐水冲洗血液至液体清亮，约100 ml。 再灌注冷的固定液 (1%多聚甲醛 和1.25%戊二醛的0.1mol/l磷酸盐缓冲 液，PH7.4， 4°C)，约500ml ,30分 钟。