2株黑松-紫色须腹菌的分离筛选及菌根辅助菌的筛选.docxVIP

2株黑松-紫色须腹菌的分离筛选及菌根辅助菌的筛选 植物根际促进细菌（pgp）是该序列的总称，可以促进植物生长，防治疾病，增加作物产量。植物根际促生细菌和外生菌根真菌(EMF)作为植物根圈微生物的重要组成类群,对植物的营养吸收、生长发育及土壤结构发挥着重要的作用。菌根辅助细菌(MHB)作为一类特殊的PGPR,是指可与菌根联结并对菌根的形成具有选择性促进作用的细菌,与菌根真菌的作用关系十分密切,是菌根学研究的热点之一。研究表明,MHB与菌根真菌双接种可显著促进菌根真菌孢子萌发、促进真菌菌丝生长、提高菌根侵染率等,从而有效地促进寄主植物生长。国外关于MHB与菌根真菌互作关系的研究已有几十年的历史,筛选出了不少MHB,并对某些优良的MHB开展了比较深入的研究,但到目前为止,我国有关MHB的筛选研究以及MHB与菌根真菌互作的报道较少。 黑松(Pinus thunbergii)被广泛应用于荒山造林、沿海防护林带的建设,并且具有极强的观赏价值。然而,近年来由于土壤贫瘠化的加剧以及松材线虫病的不断蔓延,黑松长势下降、数量急剧减少。鉴于黑松是典型的外生菌根营养型树种,外生菌根真菌(EMF)可促进黑松养分吸收,提高黑松的耐盐碱度和抗病力。本研究试图通过从黑松菌根根际土壤中分离获得菌根辅助细菌,以深入研究黑松菌根围EMF与MHB的互作,为有效提高黑松的生长和抗性提供可行的途径。 1 材料和方法 1.1 外生菌根菌株 供试细菌为南京林业大学森林病理学实验室保存的从18月生黑松—美味牛肝菌(Pinus thunbergii-Boletus edulis)和黑松—黄色须腹菌(P.thunbergii-Rhizopogen luteous)菌根苗根际土壤分离获得的81株细菌菌株。细菌培养采用胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基46。供试外生菌根真菌为美味牛肝菌(Be)和黄色须腹菌(Rl)。采用综合马铃薯培养基(ZPD)培养47。 1.2 mhb潜力菌株的筛选 1.2.1 菌株的初筛和生长 细菌菌体悬浊液的制备:将81株供试细菌活化后,用接种环取少量接种于装有50 m L TSA液体培养基中,28℃,160 r/min振荡培养72 h。4℃,5 000r/min,离心5 min,用生理盐水润洗菌体2次,最后根据离心管内菌体的数量定性加入生理盐水,混匀后即为菌体悬浊液。 采用改良的干皿对抗法初筛具MHB潜力的菌株。取灭菌培养皿,每皿接种3块直径为7 mm、厚度约5 mm的Rl菌块(倒置放置),各菌块上滴加25μL供试细菌菌体悬浊液,置于培养箱中25℃培养。每隔6 d添加25μL 0.01 mol/L的葡萄糖溶液,防止菌块干燥。待菌块生长12~16 d后,借助体式显微镜(LEICA MZ16型)观测菌根菌丝生长状况。以滴加生理盐水的作为对照,每处理设6个重复。 1.2.2 zpd培养的筛选 平板互作试验:细菌活化后,接种于装有50 m L TSA液体培养基中,28℃、160 r/min,振荡培养72h,0.22μm细菌过滤器过滤后即为含胞外代谢产物的无菌滤液。将1 m L以上滤液与ZPD琼脂培养基混合倒平板后,接种Rl菌块于培养皿中央,置于恒温培养,25℃,12~15 d后观测其菌落半径,以无菌水处理作为对照。 液体共培养试验:每50 m L ZPD液体培养基中加入3块Rl菌饼(直径7 mm,厚度5 mm),同时加入1 m L无菌滤液,25℃、160 r/min培养12~15 d,定性滤纸过滤,烘箱中60℃烘至恒质量后称质量,以TSA空白培养液为对照,每处理3个重复。测定结果采用SPSS 13.0软件进行统计分析。 1.3 外生菌根真菌基因型检测 固体菌剂的制备:固体扩大培养基质为蛭石、玉米粉和麸皮,以8∶1∶1的比例充分混匀,加入ZPD营养液拌匀,分装后121℃灭菌90 min,冷却后,接种Rl,25℃恒温培养,待菌丝长满培养基质后即制备成外生菌根真菌的固体菌剂,用于盆栽苗接种试验。 采用芽苗截根法移栽黑松幼苗,基质土与固体菌剂比例为10∶1,细菌接种液的量为5 m L/株,浓度约为107个/g。以单独接种细菌、单独接种外生菌根菌和不接种菌3种处理作为对照,每处理10个重复。置于温室中25℃培养,光照为12 h/d,适时浇水,统一管理。待黑松苗生长数月后,测量苗高、地径、湿质量等生长指标。测定结果采用SPSS 13.0软件进行统计分析。 1.4 菌根初始感染率测定 将黑松苗根系小心取出洗净,并用吸水纸将水吸干;在根系上下及周围部位随机取若干(200个左右)根段,借助光学显微镜观察记录形成菌根根段数量,计算菌根侵染率。菌根侵染率=(形成菌根根段数/总根段数)×100%。每处理取5株松苗。 1.5 菌株鉴定及pcr扩增 生物学特征观察:将筛选出的MHB菌株接种于TS