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c诱导下肝细胞生长因子基因转染大鼠脑内的表达 根据研究，血管生长因子的使用可以刺激血管生长，促进侧支循环的形成。这种现象被称为血管生成治疗性血管生成，也被称为分子桥梁移植。现在，血管生长因子基因也被用于治疗严重下肢缺血性和心绞痛的临床报告。因此，应用血管生成因子促血管生成，已被认为是治疗缺血患者的新策略。 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）是一种间质来源的促有丝分裂剂，也能刺激细胞迁移、分化及内皮细胞的管状形成，故可作为治疗缺血性脑血管病的一种选择。已有报道HGF对脑缺血具有较好的治疗效果，持续向脑内灌注重组HGF能够使脑梗死体积减小；但HGF价格昂贵，体内半衰期短，需要反复大量使用，因而限制了其临床应用。本项采用介入治疗技术与基因治疗相结合的急性脑卒中大鼠实验研究，旨在探讨CT灌注图像定位导引下，向缺血半暗带区转染HGF基因并通过其表达引起相应区域的新生血管增加，从而改善低灌注状态和减小脑梗死体积，以证实其治疗脑缺血的可行性。 1 材料和方法 1.1 egfp-hgf质粒的制备 采用基因重组技术构建PIRES2-EGFP-HGF质粒。HGF cDNA全长为2.2 kb，载体质粒PIRES2-EGFP以CMV为启动子。 1.2 急性大鼠模型 选用协和医科大学实验动物中心饲养的健康成年雄性SD大鼠，体重300～350 g，线栓法制作急性大鼠脑卒中模型。实验大鼠分为2组：注射脂质体PIRES2-EGFP-HGF质粒组和注射脂质体PIRES2-EGFP空载质粒组。 1.3 同层动态扫面ct 模型制作成功后2 h，将大鼠仰卧于平板上并固定头部，消毒后剪开右后肢皮肤暴露股静脉，用眼科剪剪一“V”字形切口，插入24 G套管针，接高压注射器。采用西门子16层螺旋CT，先以1.5 cm的层厚平扫确定扫描层面，然后以0.75 mm准直进行同层动态扫面30 s。扫描参数为：80 kV,100 mA，球管旋转一圈0.75 s，矩阵512×512,FOV 5 cm；在动态扫描的同时,团注1ml(300 mgI/ml）优维显,注射速度1 ml/s。继而将原始数据重建成1.5 mm层厚的图像6层（kernel值10），共9 mm。再经CT灌注软件处理后，获得以脑血流量（cerebral blood flow,CBF）、脑血流容积（cerebral blood volume,CBV）和达峰时间（time to peak,TTP）为参数的图像。保留原始数据用于测量栓塞侧脑血流量（CBF）（以栓塞侧与健侧的比值表示）。 1.4 大鼠脑内慢注射lipofectamchep的表达 在灌注CT图像定位下选取3点作为进针点。先正中剪开大鼠头部皮肤，刮开骨膜，使用牙科钻在选取的点上钻取小孔，按照已测量的进针深度，用微量注射器向实验组大鼠脑内缓慢注射LipofectamineTM2000/PIRES2-EGFP-HGF质粒混合物（每孔注射20μl，脂质体与质粒按2μl脂质体∶1μg质粒的比例进行混合），向对照组大鼠脑内缓慢注射LipofectamineTM2000/PIRES2-EGFP的混合物（剂量和混合比例同实验组）；基因注射完成后，缝合切口，精心饲养。 1.5 栓塞侧脑血流量扫描 大鼠术后7 d，于麻醉状态下进行脑灌注CT扫描，测量栓塞侧脑血流量（CBF）（结果以栓塞侧与健侧的比值表示）。扫描方法及参数同前。每组n=7。 1.6 免疫组化检测 大鼠术后7 d，开胸暴露心脏，经左心室灌注4%多聚甲醛固定后取脑，标本再放置于4%多聚甲醛中作外固定，以10%蔗糖浸泡24 h后行OCT包埋后于恒冷切片机上行冠状位切片，厚10μm，然后按免疫组化试剂盒说明书行免疫组化染色。HGF多克隆抗体购自RD公司，免疫组化检测试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。每组n=3。 1.7 免疫组化染色 大鼠术后7 d行脑灌注CT扫描完成后，开胸暴露心脏，经左心室灌注4%多聚甲醛固定后取脑，标本再放置于4%多聚甲醛中作外固定，以10%蔗糖浸泡24 h后行OCT包埋后于恒冷切片机上行冠状位切片，厚10μm，然后采用Santa Cruz公司的兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体进行免疫组化染色；镜下观察，于每只大鼠随机选取5个缺血半暗带区，高倍视野（40×）计数血管数。每组n=7。 1.8 梗死体积测定 各组大鼠在梗死后24 h断颈取脑，除掉额极后行冠状切割成6片，每片厚1.5 mm（与CT灌注扫描一致）；然后置于2%红四氮唑（TTC）溶液中，并在37℃避光条件下孵育30 min，缺血坏死组织呈苍白色、存活组织显示为深红色，继将染色后的脑切片放入10%甲醛溶液中固定；之后采用数码相机照相并应用影像软件（DICOMWORKS1.3.5）计算每一脑切片的梗死面积，再乘