蛋白质工程第四讲分离纯化与分析.pptVIP

一、分离纯化是分析的重要过程： 针对分析目的不同，对分析对象的要求和采取的措施不同。 若分析过程干扰很小，特异性很高，不需要对样品处理可直接测定。如：抗原及其抗体检测，配体及其配基等。 多数样品常常需要处理，才能满足检测的要求。如：蛋白质结构分析、动力学（变复性）分析、酶学性质研究等，纯度要求很高、避免干扰分析。 为了保证分析的准确度，避免检测体系中某些物质的干扰，往往对样品进行处理。 本文档共26页；当前第1页；编辑于星期三\17点51分 二、分离分析的含义： 1、分离过程本身可以是分析过程 样品干扰严重，需通过分离再检查， 分离过程和分析过程耦合，分析性色谱技术（HPLC、TLC） 2、分离过程的分析——优化纯化工艺 分离过程管理：定性分析、定量分析、纯度、结构和功能分析等 3、基本要求： 客观、准确性，反映分析对象（目的物质）的真实性。 4、分析方法要求： 选择性（特异性）、精确度、灵敏度、重复性等 第一节 概述 本文档共26页；当前第2页；编辑于星期三\17点51分 三、如何理解分离纯化与分析（三个层次） 物质的分析离不开分离： 分析要求样品的纯度：对样品进行分离纯化：如蛋白质、核酸等结构与功能关系的分析； 物质分离纯化过程离不开分析检测： 分离组分的收集、纯度、含量和组分分析；即分离过程管理。 分离纯化过程即是分析检测过程： 电泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄层层析(TLC)等； 分析是对事物的感知，是眼睛、是手段 本文档共26页；当前第3页；编辑于星期三\17点51分 一、概述 1、一般原理： 依据分离对象（物质）的溶解度、大小在相态中的分配等特性对物质进行分离纯化。 2、基本程序：样品处理、粗分和精分（例如：蛋白质的分离纯化） 3、分类： 初级分离：沉淀法、膜分离、萃取法、离心法等 精制纯化： 吸附层析、凝胶过滤、离子交换、疏水性相互作用色谱、反向色谱、亲和层析 第二节 分离与纯化 本文档共26页；当前第4页；编辑于星期三\17点51分 二、初级分离（要求：灵活运用） 目的——分离对象（物质）初步分离、浓缩、富集的过程。 方法及原理： 1、沉淀分级分离： 盐析分级：中性盐（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白质类 等电点分级： 有机溶剂： 热沉淀： 其它： 盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、 三氯乙酸、PEG、重金属等 联合使用：盐析—等电点 盐析原理示意图 本文档共26页；当前第5页；编辑于星期三\17点51分 2、膜分离： 膜分离方法及原理：透析，微滤，纳滤，超滤，反渗透，电渗析 膜材料和特性： 有机膜：（醋酸纤维素、硝基纤维素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等） 陶瓷膜：陶瓷材料 膜组件：管式膜组件，平板式膜组件，螺旋卷式膜组件，中空纤维（毛细管）等 应用：菌体分离，小分子产物分离和回收，蛋白质的分离和回收、浓缩和纯化等，膜生物反应器。 3、萃取： 4、离心： 分类：低速离心、高速离心、超速离心 分离方式：差速离心、浮力密度离心（连续梯度、非连续梯度） 5、其它：盐复合物、酸碱变性、表面活性剂、三氯乙酸、PEG、重金属等 6、联用方法：膜过滤-盐析—等电点，离心—萃取，离心-盐析—等电点等等 本文档共26页；当前第6页；编辑于星期三\17点51分 B：精制分离—色谱分离： （A）精制过程，纯度较高 （B）方法和原理：流动相和固定相的分配系数不同。分配平衡很快，流动相为平推流。 （1）吸附分离技术：吸附—解吸附平衡，固定相（吸附剂）—流动相（洗脱剂）分配系数不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的连续过程（固相和流动相之间连续分配的过程） 吸附剂：吸附剂的选择，表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。 吸附剂的选择：根据吸附剂性质和被分离对象的性质选择。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于解吸附，对于极性大的分离对象，选择极性小的吸附剂，反之亦然。吸附剂的选择依靠经验和多次试验。 本文档共26页；当前第7页；编辑于星期三\17点51分 吸附剂的种类：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等 柱层析：羟基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。 薄层层析：例如，硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析 硅胶薄层层析：硅胶板，硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)， 硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化，活化测定（约1mg苏丹黄