血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳和定量实验报告.docx

WORD 格式可编辑 生物化学实验报告 姓 名 ： 学 号 ： 专业年级： 组 别 ： 专业知识整理分享 WORD 格式可编辑 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称实验日期合作者 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验地点指导老师 评分 教师签名 批改日期 一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法； 了解电泳技术的一般原理； 掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 二、实验原理 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于 pH7.4。它们在 pH8.6 的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白 5 条区带。 血清中不同蛋白质的等电点、分子量及含量 血清蛋白质 等电点 分子量 占总蛋白的％ 清蛋白 4.64 69,000 57～72 α1－球蛋白 5.06 200,000 2～5 α2－球蛋白 5.06 300,000 4～9 β－球蛋白 5.12 90,000～150,000 6.5～12 γ－球蛋白 6.85～7.3 156,000～950,000 12～20 缓冲液 pH=8.6，pI＜pH。 专业知识整理分享 1 1．准备与点样：①取 2×8cm 的膜条；②亚光面距一端 1.5cm 处取一点样线；③充 分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；⑤点样器下端粘上 薄层血清；⑥垂直点样。 专业知识整理分享 血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 ①膜条经过氨基黑 10B 染色后显出清晰色带；②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 三、材料与方法： 实验材料： 实验试剂：①样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；②巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度 0.06mol/L）；③氨基黑 10B 染色液；④漂洗液；⑤洗脱液： 0.4mol/NaOH 溶液。 3.1.2.实验器材：①V-1100 分光光度计（×1）；②恒温水浴箱（×1）；③试管（× 6）、试管架（×1）；④1000μL 加样枪（×1）、加样枪架（×1）；⑤醋酸纤维薄膜 （2cm*8cm，厚度 120μm）；⑥培养皿（×5）；⑦点样器或载玻片（×1）；⑧平头镊子（×2）；⑨剪刀（×1）；⑩电泳槽（×1）； 直流稳压电泳仪（×1） 实验步骤 2.电泳：①放置膜条（点样面向下，点样端置于阴极）；②膜条贴紧滤纸，拉直膜条；③平衡五分钟；④通电（ 2.电泳：①放置膜条（点样面向下，点样端置于阴极）；②膜条贴紧滤纸，拉直膜 条；③平衡五分钟；④通电（调节电压 120v/电流，时间：45~60 min）；③关闭电源。 电泳槽解剖图： 注意：点样线尽量点得细窄而均匀。 8cm + — 小组标记 点样线 m 点样区 (粗面） 2cm 样品标记 1.5cm 点样示意图： 3.染色、漂洗：①通电完毕；②取出膜条；③浸于染色液（氨基黑 3.染色、漂洗：①通电完毕；②取出膜条；③浸于染色液（氨基黑10B）中，5min； ④取出膜条，浸于漂洗液；⑤反复漂洗 2 次，直至漂净；⑥滤纸吸干薄膜。 专业知识整理分享 WORD 格式可编辑 专业知识整理分享 专业知识整理分享 4.定量（洗脱比色法）（因实验室等原因，未做） 4.定量（洗脱比色法）（因实验室等原因，未做） 四、结果与讨论： 图一 染色后的膜条 结果分析 本次实验得到的图谱只能够清晰的看出清蛋白和γ－球蛋白的区带，其余无法区别。原因可能如下： ①醋酸纤维薄膜质量不足 ②薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。 ③点样太少，区带显色不明显。 ④电泳时间不足。 ⑤薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足。 ⑤取出电泳后的薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。 ⑥染色时，因为现场混乱，可能导致醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 课后思考题 电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 答：点样端置于电场的负极。因为人体血清的蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质，理应将点样端置于电场的负极。 答：点样端置于电场的负极。因为人体血清的蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负 电，要成功分离出各类各类蛋白质，理应将点样端置于电场的负极。 电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。 答：①醋酸纤维薄膜质量不足；②薄膜过湿，样品扩散