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丁香酚与血浆蛋白结合的研究 丁桂儿肚脐贴是预防和治疗儿童腹泻和腹痛的药物。它由丁香、肉桂和含有大量临床效应的成年人组成。丁香是本品的君药, 其所含挥发油具有抗菌、抗病毒、局麻、镇痛、清除氧自由基等作用, 而其挥发油中丁香酚约占80%。本实验采用平衡透析法研究丁香酚与大鼠血浆的蛋白结合率, 为进一步开展丁桂儿脐贴中丁香酚的药动学研究提供参考。 1 试剂和标准物 Agilent 1200高效液相色谱仪;TGL—16G高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;Vortex—5涡旋混合器 (金坛市盛蓝仪器制造有限公司) ;半透膜 (直径2.7 cm, 长10 cm, 美国Solarbio公司) 。 丁香酚对照品购自中国药品生物制品检定所, 批号0725-200209;内标物对羟基苯甲酸甲酯对照品购自中国药品生物制品检定所, 批号100278-200402;乙腈 (色谱纯, 美国霍尼韦尔公司) , 超纯水, 其他试剂均为分析纯。 Wistar大鼠, 180~220 g, 雌雄并用, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 合格证号:SCXX (京) 2007-0001。 2 方法和结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照溶液的制备 精密称取丁香酚对照品36.16 mg, 置10 mL量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 即得。 2.1.2 内标溶液的配制 取对羟基苯甲酸甲酯14.80 mg, 精密称定, 置100 mL量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得148.00 μg/mL内标溶液。 2.1.3 磷酸盐缓冲液的制备 取磷酸二氢钾2.72 g, 氯化钠8.8 g, 加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液适量, 调节pH值至7.4, 补水至1 000 mL, 即得0.02 mol/L磷酸盐缓冲液 (内含0.15 mol/L氯化钠) , 作为透析液。 2.2 流动相及进样量 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱 (150 mm×4.6 mm, 5 μm) ;流动相:乙腈 (A) -0.1%磷酸溶液 (B) , 梯度洗脱, 0→20 min (A20%→80%) , 20→30 min (A80%→20%) ;检测波长为260 nm;进样量:10 μL。理论板数按丁香酚峰计算应不低于1 500。见图1。 2.3 样品处理 2.3.1 沉淀血浆蛋白 取大鼠血浆200 μL, 加入内标溶液50 μL、0.1 mol/L盐酸溶液50 μL, 加甲醇0.5 mL沉淀血浆蛋白, 涡旋混合30 s, 以12 000 r/min离心5 min, 取上清液, 即得。 2.3.2 盐酸溶液的配制 取透析外液200 μL, 加入内标溶液50 μL、0.1 mol/L盐酸溶液50 μL, 加入甲醇0.5 mL, 涡旋混合30 s, 以12 000 r/min离心5 min, 取上清液, 即得。 2.4 线性关系研究 2.4.1 加样分析 取丁香酚的储备液适量, 用甲醇稀释成系列对照品溶液, 取200 μL空白血浆6份, 分别加入丁香酚的系列对照品溶液50 μL, 配成相当于723.11、144.62、28.92、5.78、1.16、0.23 μg/mL的血浆样品, 按血浆样品的处理项下方法操作, 取10 μL进样分析。以丁香酚与内标的峰面积比值对质量浓度进行线性回归, 计算回归方程为Y=0.001 6X+0.001 1,r=0.999 9, 线性范围为0.23~723.11 μg/mL。 2.4.2 透析液样品处理 取丁香酚的储备液适量, 用甲醇稀释成系列对照品溶液, 取200 μL空白磷酸盐缓冲液6份, 分别加入丁香酚的系列对照品溶液50 μL, 配成相当于723.11、144.62、28.92、5.78、1.16、0.23 μg/mL的透析液样品, 照透析液样品的处理项下方法操作, 取10 μL进样分析。以丁香酚与内标的峰面积比值对质量浓度进行线性回归, 计算回归方程为Y=0.001 7X-0.009,r=0.999 5, 线性范围为0.23~723.11 μg/mL。 2.5 回收率及精密度 分别在空白血浆、透析液中加入丁香酚对照品溶液, 使其质量浓度分别为144.62、28.92、5.78 μg/mL, 每个质量浓度平行作6份, 按样品处理项下方法操作, 进行HPLC分析, 以当日的标准曲线计算丁香酚实测值, 计算相对回收率 (相对回收率=C实测/C理论×100%) 。结果血浆高、中、低3个质量浓度的相对回收率分别为100.10%、97.74%、103.02%, RSD分别为3.63%、4.42%、5.49%。透析液高、中、低3个质量浓度的相对回收率分别为97.86%、98.07%、99.88%, RSD分别为1.